核酸杂交技术案例.ppt

在核酸杂交反应中影响杂交体形成因素较多，主要有探针的选择、探针的标记方法、探针的浓度、杂交率、杂交最适温度、杂交的严谨性、杂交反应时间及杂交促进剂等。 一、探针的选择 在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。 但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。 二、探针的标记方法 探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。 但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。 一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。 三、探针的浓度 随探针浓度增加，杂交率也增加。 在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。 探针浓度过低会降低杂交的灵敏度，过高又会增加背景的染色。 一般认为，最佳原则是应用与靶核苷酸探针达到最大结合度的最低探针浓度。 四、杂交率 传统杂交率分析主要用于DNA复性研究，在这种情况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同。 现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度不能精确计算。 五、杂交温度 理想的情况是在杂交速率最大的温度条件下进行杂交反应 对RNA：DNA杂交来说，最大速率的产生点为Tm值下10~15℃； 在DNA：DNA杂交中选择低于Tm值20~25℃的杂交温度。 六、杂交的严谨性 严谨性（stringency)是指杂交体系避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。 影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严谨性，一般认为在低于杂交体Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式计算杂交体Tm 值。通过调节 盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。 七、杂交反应时间 C0t1/2是杂交反应进行一半时杂化分子的浓度， C0t1/2越大反应越快。 复杂性( complexity)或者说序列的复杂性是指在DNA或RNA样品中不同序列的总长度，如果有机体中不存在重复序列，DNA的复杂性与其基因组长度相当。 重复序列的复杂性与其单一拷贝的复杂性相当，和其重复次数无关。 八、杂交促进剂 惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。 而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。 Questions 1. 核酸分子杂交的基本原理。 2. 核酸探针的种类及其标记方法。 3. 核酸探针的检测。 4. 核酸分子杂交的传统方法。 5. 原位杂交概念、基本步骤及其应用。 * BCIP 　　(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate) 　　5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐, BCIP＋NBT（四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶最佳的底物组合之一, 产物为深蓝色. 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。NBT/BCIP染色试剂盒用于蛋白印迹和免疫组化等染色。本试剂盒可以用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色，也可以用于Western等结合有碱性磷酸酯酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。( 条件是有5’-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链DNA需用碱性磷酸酶切除5’-P后再标记 5′p-HO-CpGpTpA……3′ 5′HO-CpGpTpA……3′ T4噬菌体多核苷酸激酶 [γ-32P]-ATP 5′32p-O-CpGpTpA……3′ 37℃，反应10min, γ-32P-ATP 需150 μci/反应 1) DNA的5′末端标记 碱性磷酸酶 (3) DNA的末端标记 5′ 3′ 3′ 5′ 完整双链DNA 限制性内切酶 5′ 3′ 3′ 5′ [α-32P]-dNTP 其他3 种dNTP Klenow DNA聚合酶 5′ 3′ 3′ 5′ 变性 5′ 3′ 3′ 5′ 5′末端突出的DNA 3′末端标记的DNA 32P-末端标记的单链DNA探针 2) DNA的3′末端标记 二、分子杂交信号检测 （一）放射性标记探针检测 1、放射自显影 2、液体闪烁计数法 （二）非放射性标记探针的杂交检测 1、酶促显色检测 2、荧光检测 3、化学发光检测 4、多探针检测 （一）放射性标记探针检测 1.放射自显影 放射性杂交的检测基于放射性核素释放的能量将照片纸感光的原理。 用32P标记杂交最常用的检测方法是放射自显影。 2.液体闪烁计数法 液体闪烁计数法的工作原理是被测样品辐射发出的辐射能经溶剂分子传递给闪烁剂分子，当被激发的闪烁剂分子从激发态退激为稳态时，以荧光光子的形式辐射能量，经光电倍增管放大并被测量，就可以实现对放射性核素的测定。 （二）非放