关于大鼠跟腱异位骨化模型中低氧诱导因子-1α的表达及作用.docVIP

关于大鼠跟腱异位骨化模型中低氧诱导因子-1α的表达及作用 　　异位骨化是骨科领域中一种十分常见的疾病。研究表明HIF-1alpha; 可激活VEGF 的表达, 在骨修复方面发挥重要作用。本研究通过建立大鼠跟腱异位骨化模型, 观察创伤早期不同时间点局部组织中HIF-1alpha; 及VEGF 水平变化, 初步探讨HIF-1alpha; 及VEGF 在异位骨化发生、发展中的价值。 　　1　材料与方法 　　1. 1　材料 　　1. 1. 1　实验动物 　　6~8龄雄性SD 大鼠 60只, 平均体重(131.4plusmn;11.6)g, SPF 级环境饲养( 深圳北京大学香港科技大学医学中心)。 　　1. 1. 2　主要试剂　HIF-1alpha; 多克隆抗体试剂盒, 抗鼠二抗,TRIzol、DNA Marker, 逆转录试剂盒。 　　1. 1. 3　主要仪器　PCR 扩增仪GeneAmp9600, 紫外线分光光度仪, Odyssey 红外线扫描成像系统, 琼脂糖凝胶显像系统4100、天能凝胶成像和分析系统4100。 　　1. 2　动物模型制备及分组 　　60 只大鼠适应性饲养1 周后随机分为实验组和对照组, 每组30 只。实验组：无菌条件下,于大鼠右后肢作后外侧入路暴露跟腱, 用血管钳反复钳夹5次, 造成一定创伤, 然后在中点将跟腱完全切断, 不予缝合,关闭切口。对照组：同实验组方法暴露跟腱, 不作任何处理,直接关闭切口。 　　1. 3　观测指标 　　1. 3. 1　术后观察两组大鼠成活、切口愈合情况。各时间点观察两组大鼠跟腱大体形态。 　　1. 3. 2　免疫印迹试验(Western-blot) 检测HIF-1alpha;及VEGF蛋白含量　RT-PCR 检测HIF-1alpha;及VEGF 基因表达。 　　1. 4　统计学方法 　　采用SPSS13.0 统计学软件进行分析。计量资料用均数plusmn; 标准差( x-plusmn;s) 表示, 采用t 检验。Plt;0.05表示差异有统计学意义。 　　2　结果 　　2. 1　大体观察 　　所有大鼠均存活至实验完成, 切口愈合良好。术后10 周, 实验组跟腱组织可见软骨样组织;对照组跟腱组织未见软骨样组织。 　　2. 2　HIF-1alpha;及VEGF 蛋白及基因检测 　　各时间点实验组HIF-1alpha;及VEGF 的蛋白含量及基因相对表达量均显著高于对照组, 比较差异均有统计学意义(Plt;0.05)。实验组组内不同时间点比较, HIF-1alpha;及VEGF 基因相对表达量各时间点比较, 差异无统计学意义(Pgt;0.05)。 　　3　讨论 　　异位骨化的发生、发展过程中, 呈明显的连续性。HIFs是组织细胞在低氧状态下诱生的转录因子, 包括3 种亚型(HIF-1、HIF-2、HIF-3)。现在的研究集中于HIF-1 及其感应元件HIF-1alpha;, 在血管重塑、葡萄糖和能量代谢、红细胞生成、细胞增殖、凋亡等方面发挥重要作用。低氧诱导因子(hypoxia inducible factors, HIFs) 是诱导低氧基因和修复细胞氧内环境稳定的核心因子。 　　籍骨生长模型, 针对生长板区域的HIF-1alpha; 含量及其变化特性的研究发现, 生长板软骨细胞外基质呈梯度性缺氧状态, 诱导HIF-1alpha; 呈不同水平的表达, 其中央部位尤甚;软骨细胞HIF-1alpha; 基因条件性敲除后, 生长板中央处软骨细胞死( 凋) 亡。指出适量水平的HIF-1alpha; 可使软骨细胞尤其是早期肥大细胞存活期延长而使基质钙化逐渐弥散。当进行性升高的HIF-1alpha; 达一定程度, 便会通过信息呈递和( 或) 其主要靶基因-VEGF 及其受体Flt-1(fms-like tyrosine kinase)、KDR(kinase domain region) 介导, 诱导血管侵入, 有效的屏障作用而因此丧失, HIF-1alpha; 被降解, 如此交替, 这有可能是透明软骨雏形和出生后生长板软骨细胞分裂、增殖、肥大、变性、坏死和软骨基质的钙化, 有序而规律的主要调节机制。对这些现象进一步的研究表明： HIF-1alpha; 在骨折修复重建过程中, 对软骨内成骨发挥了相同或类似的调节作用。 　　在HIF-1alpha; 的作用下, 其下游最关键的因子之一, VECGF已经被证明可以促进成肌细胞分化, 并增加其血管化和预防凋亡。阐明其中的细胞分子生物学行为表现形式及其规律, 将有可能成为加深认识创