讨论马钱子碱和士的宁的硅胶柱色谱与半制备高效液相色谱法联用分离纯化.docVIP

讨论马钱子碱和士的宁的硅胶柱色谱与半制备高效液相色谱法联用分离纯化 　马钱子Strychnos nux 一vomica L. 性寒、味苦，具通络止痛、散结消肿之功效，临床上常用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、麻木瘫痪等疾病。其主要有效成分为单萜吲哚类生物碱，以马钱子碱、士的宁含量居多，约占总生物碱70% 左右。研究表明，在治疗风湿痹症的临床应用上，马钱子镇痛作用的有效成分主要是马钱子碱。传统中医药研究以马钱子中的士的宁为主要有效成分，而以马钱子碱为毒性成分，炮制方法力求尽量去除马钱子碱，并且将士的宁的含量作为马钱子炮制品的质量评价指标。士的宁是一种中枢神经兴奋剂，医疗中可用于治疗瘫痪、弱视症及再生障碍性贫尿，但由于其毒性较大，临床应用往往受到限制。因此分离纯化马钱子碱、士的宁单体，是深入研究其单一成分的药效及毒性的必要前提。 　　传统分离马钱子碱、士的宁单体的方法多采用硅胶或大孔吸附树脂，经反复柱层析，再结合重结晶得到少量纯品，传统分离方法不仅耗时，且浪费溶剂。目前已有文献报道采用高速逆流色谱法分离马钱子碱和士的宁，但本课题组在应用高速逆流试验中，发现仪器的稳定性及调试维修等会直接影响分离效果，且分离条件复杂，两相溶剂体系选择困难，分离时间较长。半制备高效液相色谱具有分离速度快、产品纯度高、产率高、重复性好等优点，广泛应用于中药活性单体的分离纯化，目前未见文献报道采用半制备高效液相法分离纯化马钱子中有效成分。本文通过硅胶柱色谱与半制备高效液相色谱法联用快速从马钱子中分离出马钱子碱、士的宁单体，建立了一种快速分离马钱子碱、士的宁单体的方法。 　　1 仪器与材料 　　1. 1 仪器FA1604S 分析天平( 上海天平仪器厂) ; XS205 电子微量天平( 瑞士Mettler Toledo 公司) ; Waters( 515 - 717 - 486) 分析高效液相色谱仪( 美国Waters 公司) ; 岛津( LC - 6AD - SPD -20A - CBM - 20A) 半制备高效液相色谱仪( 日本岛津公司) ; pH酸度计( OHAVS，STARTER2100) 。 　　1. 2 试药马钱子碱对照品( 批号: 110706 - 200505，纯度95. 9%) 、士的宁对照品( 批号: 110705 - 200306，纯度97%) 均购于中国药品生物制品检定所; 马钱子购于杭州华东中药饮片有限公司，批号: 101011，经该公司质检科主管药师郑霄鹰鉴定为马钱科植物马钱子Strychnos nux - vomica L. 的干燥成熟种子; 甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯; 柱层析硅胶200 - 300 目( 青岛海洋化工厂) 。 　　2 方法 　　2. 1 色谱条件分析HPLC 色谱条件: 色谱柱: Agilent ZORBAXSB - C18柱( 150 mm times; 4. 6 mm，5 mu;m ) ; 流动相: 乙腈- 0. 01mol /L 庚烷磺酸钠与0. 02 mol /L 磷酸二氢钾等量混合( 10%磷酸溶液调pH 为2. 8) ( 21∶ 79) ; 检测波长: 254 nm; 柱温: 25℃; 流速: 1. 0 ml /min; 进样量: 20 mu;l。半制备HPLC 色谱条件: 色谱柱: Silica C18M 10E ( 250 mm times;10 mm，5 mu;m) ; 流动相: 乙腈( A) ∶ 水- 冰乙酸- 氨水( 230∶2. 4∶ 0. 4) ( B) = 12 ∶ 88; 检测波长: 254 nm; 柱温: 25℃; 流速:2. 0 ml /min; 进样量: 500 mu;l。 　　2. 2 对照品溶液的制备精密称量马钱子碱、士的宁对照品适量，甲醇溶解，流动相稀释至浓度分别为49. 2 mu;g /mL，49. 0mu;g /mL。 　　2. 3 马钱子总生物碱的提取将马钱子干燥药材粉碎，过10 目筛。称取粉末2. 0kg，按1∶ 10 料液比加入pH 5 的50%乙醇溶液浸泡0. 5 h，回流提取3 次，每次1 h，第二、三次残渣加5 倍量pH 5的50%乙醇溶液加热回流提取，合并提取液，过滤，置旋转蒸发仪上回收乙醇，浓缩至相对密度为1. 15 ～ 1. 25( 60℃) 。浓缩液用40% NaOH 溶液调pH 至12，二氯甲烷萃取3 次，每次加浓缩液体积的2 倍，合并萃取液，减压除去二氯甲烷，即得36. 4g 马钱子总生物碱，其马钱子碱含量为18. 8%，士的宁含量为37. 2%。 　　2. 4 马钱子总生物碱的初步纯化称取硅胶约100 g 加入至60ml 含1%氢氧化钠的95% 乙醇溶液中进行碱化，水浴挥干乙醇后，二氯甲