流式细胞术应用2009newnew幻灯片.pptVIP

FACSCalibur BD LSR FACS Vantage DiVa FACSAria 流式细胞术的发展史 1934年细胞在显微镜载物台的毛细管中流过。 1949年流动的悬浮粒子计数方法—Coulter效应。 1967年发展了一种液流束、照明光轴、检测系统三者垂直的流式细胞仪。 80年代出现了完善的流式细胞仪。 显微镜的发展史 显微镜的发展史 流式细胞术的奠基人 1970年的流式细胞仪 1975年的流式细胞仪 Coulter Electronics manufactured the TPS-1 (Two parameter sorter) in 1975 which could measure forward scatter and fluorescence using a 35mW argon laser. 1977年的流式细胞仪 1977-78 developed the Epics series of instruments which were essentially 5 watt argon ion laser instruments, complete with a multiparameter data analysis system, floppy drive and graphics printer. 流式细胞仪概述 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种自动分析细胞的高技术，其原理是悬浮在液体中的分散细胞一个个地依次通过测量区，当每一个细胞通过测量区时产生电信号，这些信号可以代表荧光、光散射，光吸收或细胞的阻抗等。这些信号可以被测量、存贮、显示，于是细胞的一系列重要的物理特性和生化特性就被快速地、大量地测定。 上述特性可以是细胞的大小、活性，核酸的数量、酶、抗原等等。仪器还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个细胞群体中分选出来。 流式细胞术在当前的细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、遗传学、病理学、临床检验学等各领域有着十分广泛的用途。 流式细胞术是对悬液中的细胞或细胞器进行快速可达每秒钟数千个乃至上万个细胞。 显微镜术可以研究组织的结构、细胞定位和荧光在细胞中的分布。 流式细胞术是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的总核酸，总蛋白等，这是它的不足之处。 Fluorescence Microscope withColor Video (CCD) 35 mm Camera 荧光显微镜的细胞荧光定量 流式细胞仪概述 现代荧光技术和多参数相关测量技术的发展，流式细胞术在细胞群体或组成群体的亚群进行定量分析时，具有其他手段无法比拟的优越性。 流式细胞仪的结构 一. 流动室及液流驱动系统; 二. 激光光源及光束成形系统; 三. 光学系统; 四. 信号检测与存贮、显示、分析系统; 五. 细胞分选系统。 细胞流动室 细胞流动室是FCM的心脏，它是根据流体力学中的层流鞘液原理设计而成，其结构包括石英小室形成的鞘液腔及插入其中的样品管。细胞呈单个排列通过流动室。 流式细胞仪的液流系统示意图 激光光源与光束形成系统 激光 (Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的光照 激光波长: 488nm, 635nm及UV 激光器 常用激光器： 氢离子激光器 488nm兰色激光 氩离子激光器 氪离子激光器 聚光系统和检测系统 透镜、小孔、多种滤片 检测器、放大器将光信号变成电脉冲信号 计算机 信号变成数据文件存储、分析。 流式细胞仪的工作原理 待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱。液柱与入射的激光束垂直相交，相交点称为测量区。 流式细胞仪的工作原理 通过测量区的细胞被激发产生荧光。在与入射光束和液柱垂直的方向放置光学系统（透镜、光阑、滤片和检测器等）用以收集荧光信号。阻断滤片用于阻挡激发光，二色性反射镜用于选择被测荧光波长，荧光检测器是光电倍增管（PMT），散射光检测器是光电二极管，用来收集前向角散射光（FSC）。 光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成 流式细胞仪的原理 流式细胞仪的原理 信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激