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帕金森病模型大鼠神经干细胞移植基础研究 【摘要】：帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是一种发生于中老年期的,缓慢进展的神经系统退行性疾病,主要病理改变为中脑黑质致密部(substantianigraparscompacta,SNc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性死亡,导致纹状体来自黑质的DA能神经末梢减少,从而引起震颤、肌肉僵直、运动迟缓与体位不稳等一系列综合病症(LothariusandBrundin,2002)。PD是继阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)之后第二大常见的神经系统退行性疾病,随着人口平均寿命延长和老龄化出现,PD的发病率呈现明显的上升势头。药物治疗以及脑深部电极(deep-brainstimulation,DBS)埋藏治疗可在一定程度上缓解患者的症状,但都存在一些副作用,而且不能从根本上抑制脑内DA能神经元的持续性死亡。近年来神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)的研究为细胞替代疗法治疗PD提供了潜在的应用前景,通过移植神经干细胞不但可以来替代部分丢失的的DA能神经元的功能,而且可以通过移植具有分泌神经营养因子特性的细胞抑制DA能神经元的丢失,长期有效地改善患者的症状。在本研究的第一部分,我们利用本实验室建立的胚胎大鼠NSCs的取材和培养方法,分离E14SD大鼠胚胎前脑室下带区(subventricularzone,SVZ)神经组织,在含有多种神经营养因子的无血清培养基中悬浮培养,经传代后培养出大量NSCs标记分子——神经巢蛋白(neuroepithelialstemcellprotein,Nestin)阳性克隆球团。经免疫组织化学方法检测,这些阳性细胞克隆球团经诱导分化后可以分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,此结果说明本实验取自E14SD大鼠SVZ区域的细胞具有自我增殖和多潜能分化特性。为长期跟踪移植细胞在体内存活、生长、迁移及分化的过程,我们运用用携带有增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因的重组腺相关病毒(rAAV_2-EGFP)在体外培养条件下感染NSCs,通过病毒在细胞内表达EGFP使细胞带有绿色荧光标记。实验中发现,被AAV_2-EGFP感染后的NSCs仍具有持续的分裂增殖能力。EGFP标记的NSCs体外诱导分化后,整个细胞从胞体到突起末梢都带有绿色荧光标记,较好显示出了细胞的完整形态,经测定,体外EGFP标记率为65%。在第一部分研究,我们成功建立了NSCs的分离、培养、鉴定和EGFP标记示踪的方法。PD在动物中没有自发倾向,进行PD实验研究需要建立适当的动物模型(陈生弟,陈先文,2003)。建立稳定的能模拟人类PD病理学和行为学改变的动物模型,对PD的发病机制和治疗等方面的研究具有重要的意义。PD大鼠模型由于可直接观察行为学改变、经济和易于操作等原因,成为目前应用最广的研究模型。现在PD模型的制作方法较为成熟,常用的是6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)损毁模型。在第二部分实验中,我们采用了单点内侧前脑束(medialforebrainbundle,MFB)注射6-OHDA方法制备一侧黑质损毁PD动物模型。共制备模型105只SD大鼠(SpragueDawley,SD)。建模4周后经阿朴吗啡(apomorphine,APO)诱发旋转,旋转7r/min以上者为成功模型,共有57只,行为学检测造模成功率为54%。模型动物造模成功后分别在30,60和120天后再次进行行为学检测以跟踪动物的自我恢复可能性,统计结果显示与造模成功后的初次检测结果无显著性差异(P＞0.05),表明PD模型稳定,没有自我修复现象。对PD模型组动物中脑黑质酪氨酸羟化酶(tyrosionhydrozylase,TH)免疫组织化学检测发现,成功PD大鼠中脑黑质正常侧TH反应阳性神经元数量较多,胞体较大,突起明显;而6-OHDA损毁侧TH阳性神经元数量则明显减少,细胞丢失超过90%以上。120天后PD模型动物损伤侧神经元数量减少仍然在90%以上,从组织学上证明模型的稳定。我们对成功的PD模型大鼠和正常大鼠分别在黑质或纹状体移植rAAV_2-EGFP标记的NSCs,移植后30、60和120天进行行为学检测。结果表明,NSCs移植到PD大鼠黑质或者纹状体,随着移植细胞在宿主脑内存活时间的延长,动物的行为学症状得到显著改善(P＜0.05,P＜0.01)。在NSCs移植疗法中,NSCs作为一种外源性物质能否在损伤的黑质区域存活或者迁移,能否向黑质特定DA能神经元分化是细胞移植治疗PD疗效的关键。在第三部分实验中我们研究了移植细胞的行为变化。在细胞移植后30、60和120天