药物与糖蛋白、细胞膜、细菌相互作用的毛细管电泳方法研究.pdf

Capillary Electrophoretic Methodologies for Studying the Interactions of Drug with Glycoprotein, Cell Membrane and Bacteria A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Doctor ’s Degree of Engineering By Lixian Li Supervised by Prof. Zhining Xia Specialty: Biopharmaceutical Engineering Bioengineering College of Chongqing University, Chongqing, China April, 2013 中文摘要 摘 要 生物大分子、靶体、细胞与药物相互作用研究是现代高通量药物筛选的重要 基础，毛细管电泳是研究分子间相互作用的重要技术手段之一。为了更好地了解 生物分子与小分子间的相互作用，本论文以细胞内的生物成分（糖蛋白）、细胞部 分组织（细胞膜）以及完整的细胞（细菌）为研究对象，采用不同模式的毛细管 电泳方法，对生物分子与药物间的特异性相互作用及非特异性相互作用进行了系 统性研究。研究内容主要包括三部分： 第一部分：以生物大分子糖蛋白为受体，基于硼酸基团与顺式二羟基化合物 的特异性络合作用，研究了糖蛋白与硼酸间的特异性相互作用机理及其应用。 首先，采用毛细管电泳等电聚焦-整体柱成像检测(CIEF-WCID)实时在线研究 了硼酸与糖蛋白的特异性相互作用机理。结果发现，加上电压后，载体两性电解 质在毛细管分离柱上形成不同的pH 梯度，从而为硼酸与糖蛋白的相互作用创造不 同的pH 环境。当硼酸浓度增大到0.05 mol/L 时，在电泳谱图中可以直观地看到硼 酸与去唾液酸胎球蛋白产生的复合物的峰。同时，通过实时监测硼酸与去唾液酸 胎球蛋白相互作用过程，发现硼酸与去唾液酸胎球蛋白复合物的峰一直往高pH 位 置迁移，在监测的50 min 里，复合物峰从pH=5.88 的位置逐渐迁移到pH=8.22 的 位置，这一规律正好符合了硼酸与糖蛋白亲和作用的工作机理。WCID 具有信息量 大、实时获得各组分的动态信息、分析时间短及高通量等优点，可获取更多相互 作用的重要信息，是相互作用研究的一个重要手段。 接着，利用硼酸与糖蛋白的特异性相互作用机制，选择两种不同孔径大小的 氨基苯硼酸为涂层萃取材料，建立了一种选择性萃取糖蛋白的固相微萃取方法， 并采用CIEF-WCID 对萃取后的样品进行了快速分析检测。在最优化条件下，从标 准缓冲液、磷酸盐体系、血浆和血液等不同基质中萃取及富集糖蛋白。 第二部分：以红细胞膜为研究对象，采用峰漂移法及动力学毛细管电泳两种模 式研究了药物与细胞膜相互作用的过程，建立了基于毛细管电泳测定药物与细胞 膜相互作用参数的方法。 首先，以细胞膜在毛细管内构成假固定相，采用亲和毛细管电泳研究细胞膜与 药物的相互作用。以西酞普兰和兔红细胞膜为相互作用模型，以不同浓度的细胞 膜混悬液为电泳缓冲液，采用峰漂移法，并结合Scatchard 分析，测得西酞普兰、 依匹斯汀与兔红细胞膜的结合常数。该方法简单、快速，为研究药物与细胞膜的 相互作用提供了新的技术手段，为高通量筛选药物膜通透性和活性，以及评价药 物在体内吸收提供一种新的方法。 I 重庆大学博士学位论文 在研究细胞膜与药物相互作用的过程中，发现药物在跨膜转运过程中存在动 力学过程。于是，在区段-区段动力学毛细管电泳（ppKCE ）的理论基础上，以兔