22二甲基环丙腈水合酶产生菌的氮离子注入选育及突变株产酶条件的研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四班奎固发酵工程学术讨论舍论文枭 2，2一二甲基环丙腈水合酶产生菌的氮离子注入选育 及突变株产酶条件的研究 吴玉峰，郑裕国。，沈寅初 (浙江工业大学生物工程研究所杭州310014) 摘要：离子注入技术近来越来越受到国内外的关注，并被广泛应用于微生物的品种敢是。 利用N+离子注入法对丰实验室保藏的产2，2-二甲基环丙腈水旮酶曹种Pseudomonas sp． zJUT0509进行选育。结果表明，通过离子蒋变后的究变株的腈水台酶活性最高可选厚始菌 株的9倍。对其中F60—4菌种进行产酶条件的优化，其最佳碳、氮辣及其用置分别是葡萄 糖，29／1和酵哥粉，109／l，最适初始pH值为6．5，最适发酵温度为20℃． 关键词：氪离子注入；腈水台酶，2，2-二甲基环丙甲腑12，2一二甲基环丙甲酰胺 引 言 腈类化台物是一种自然界中广泛分布的有机化合物，在化工产业及有机合成中有着 重要的地位。目前，利用微生物中腈水合酶来催化腈类化合物已被成功地应用于生物催 化生产丙烯酰胺、烟酰胺等“]。随着对手性物质价值和利用生物实现立体选择性合成的 潜力的不断认识，科学家们纷纷把目标转向了利用腈水合酶和酰胺酶立体选择性催化合 成相应的手性酸的研究o～。2，2一二甲基环丙甲酰胺是一种手性化合物，有R和s两种 构型．但有生理活性的只有S型。外消旋的2，2甲基环丙甲酰胺经过手性拆分可以得 能抑制亚胺培南(imipenem)在肾内代谢，增加泌尿道中亚胺培南浓度，并减少其肾毒性。 它与亚胺培南的复方制剂——泰能(Tienam)特别适用于多种菌联合感染以及需氧菌和 厌氧菌的混合感染，是目前临床用以治疗重症感染的首选药。化学法生产2，2甲基环 丙甲酰胺路线长、收率低，反应条件苛刻。相反，生物法生产条件温和，环境污染少。生 物法通常利用腈水合酶催化2，2一二甲基环丙甲腈生成2，2甲基环丙甲酰胺，由于2．2一 二甲基环丙甲腈对菌株产生一定的毒性，所以野生菌株对其的催化能力有限，故需要对 菌株进行改良，以提高腈水合酶的活性。 离子注人技术最初应用于半导体和金属表面改性研究[7]。八十年代，中国科学家独 基金硪目：国家973计划项目(No．2003CB716005) 国家高等教育部博士点项目(No．20051033701) 作者简介：吴玉峰(1981一)女，浙江人，硕士生，研究方向为生物合成和生物转化 *通讯作者：Tell86--571---maill zhengyg@zjut．edu．cn 吴玉峰等：2，2-=甲基环丙腈水合酶产生菌的氮离子注人选育及突变株产酶条件的研究 133 辟蹊径，开始了注人离子与生物体系相互作用过程的探索，到1986年发现了离子注入生 物学效应…，并将这一原理应用于诱变育种、细胞加工和基因转移，由此开始了离子柬生 物工程学的先河。经过多年的努力和实践，该技术在植物、动物和工业微生物品种改良 上取得了良好的效果“，为生物的遗传改良开辟了一条新途径，引起了国内外学者的关 注。 本实验利用N+离子注入法对产腈水合酶菌种进行选育．旨在进一步提高酶活，为下 一步的动力学拆分提供原料。 2材料和方法 ’ 2．I材料 2．1．1菌株：Pseudomonassp．ZJUT0509，由本实验室保藏 2．1．2培养基 1．0， 斜面培养基(g／1)：葡萄糖10．0，酵母膏3．0，K2HP010．2，MgSo．0．2，NaCI 7．2～7．6 琼脂20，pH 0．3，