AFLP分子标记技术及在犬育种研究中的应用前景.pdfVIP

AFLP分子标记技术及在犬育种 研究中的应用前景 马长书1杨前勇1马巍2 l公安部南昌警犬基地2南京农业大学动物繁育研究所 摘要：Art?(扩增片段长度多态性)技术因其无需了鹪待测DNA序列、高效且分辨率 高、萤复性好等特点已被应用于构建遗传图谱、遗传多态性分析、品种鉴定、疾病诊断等的 研究中。本文介绍了AFLP技术的原理、方法、特点、技术关键，阐述了AFLP在犬育种中的 应用前景。 关键词：A凡P；犬；应用前景 fragnent hFLP(amplifled Mare和Vos 标记系统基础上发展起来的分子标记…，是由Zabeau Pieter于1992年创立[2J，于 1993年获欧洲专利局专利(专利号EP0534858AI)。该技术首先运用于植物分子生物学的研 究中【3】，但因在操作过程中其不需要了解待测DNA序列、快速、高效，且分辨率高、重复性 好、易于标准化等特点很快被推广到生物学的各个领域，如遗传图谱的构建、遗传多样性和 系统发生、基因或基因组区域特异性标记的筛选和定位、细菌鉴定以及疾病诊断和肿瘤等 方面的研究”“J。 1．AnP的原理和方法： 利用一段引物以解链后的单链DNA为模板，沿着5’到3’方向把核苷酸连续加在延伸的3’羟 基上复制DNA。由于不同物种或不同品种的基因组DNA大小不同，对引物所诱导复制的特 定DNA片段采用PER技术进行扩增，然后用电泳方法将扩增的DNA片段分离，即可使某一 品种出现特定的DNA带谱(即扩增片段长度多态性)，而在另一品种中可能无此谱带产生， 因此这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记，即AFLP 标记。 AFLP技术包括三个步骤【9J：①用密切酶和稀切酶两个切割频率不同的限制性内切酶消 化基因组DNA．然后在切口处连接含相同内切酶位点的“接头”(Adapter)；②选择性扩增酶 切片段，根据接头设计引物，AnP的引物包括与人工接头互补的核心序列(CORE)、限制性 内切酶识别序列(ENZ)和3’端选择性碱基三部分。扩增时一般采用两步法，首先用单选择 碱基的引物进行预扩增反应，预扩增产物稀释后甩2～3选择碱基选择性扩增。采用两步法 的优点是可以提高扩增特异性，降低AFLP图谱的弥散背景，可使扩增带数减少，从而使产 生的指纹图谱更清晰和具有更好的重复性，再者是提供大量的模板DNA；③扩增片段通过 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。检测基因组困限制性酶切位点、选择性碱基结合位点 所发生的碱基突变、插人、缺失或替换而产生的扩增片段有无多态，或因两选择性引物结合 位点区域间存在碱基插人或缺失而导致的扩增片段长度的多态。在不需要事先知道DNA 序列信息的前提下，就可对酶切片段进行经典的PCR扩增。 2．AFLP的特点 58 AFLP综合了RFLP和RAPD技术的优点，可检测到分布于全基因组上的DNA片段。 AFLP技术虽诞生的时间很短。但由于其独到的检测DNA多态性的方式，已成为基因组研究 的非常有用的工具，备受遗传学家和分子学家的青睐，应用范围越来越广泛，其独特的优点 有：①A兀P同RAPD一样，不需要预先知道所要扩增DNA的序列，适合对遗传背景不多和 基因组研究不充分的种类进行分析。不论来源和复杂性如何，任何DNA都可得到AFLP的 指纹图谱；②具有一定的灵活性，可通过特异性PCR引物的设计和内切酶组合的选择以及 选择性扩增碱基的数目去控制AFLP图谱中条带的数量；③多态性强，分辨率高。AHP技 术是针对整个基因组的，因此可同时对随机分布在染色体上的许多不同的DNA区域多位点 进行分析，而且KFLP可获得高密度标记与其它遗传标记相比，A兀P具有最高的信息含量 (许占友等，2000)。这些AFLP标记中至少有部分标记位于变异的区域，因此可以展示种群 内微小的遗传变异，并可以用测序凝胶来区分AFLP扩增带间的单个核苷酸的差异；④重复 性好，脏IP需高质量的DNA和过量的酶可以克服因DNA的酶切不完全而产生的失真，特 异性的PCR引物、两步法的扩增和较高的退火温度(5CC)将误差减少到最低限度。Jmaes等 6％。 [10]用AFLP探针在