动物性食品中大肠杆菌O157H7的特异性二重PCR检测.pdfVIP

相应的操作程序、管理制度、考核标准，对可能出现的危害加以预防和控制。 4小结 在江苏泰州丰达种鸭场的肉鸭生产过程，共确定了种鸭、饲料、防疫、药物治疗四个关键控制点， 针对这四个关键控制点，本文对原料鸭生产制定了质量控制表。(表1-2，l-3，1-4，1．5)。经质量控 制后，肉鸭各项检测指标都达到了绿色食品的卫生标准。 动物性食品中大肠杆菌0157：H7的特异性二重PCR检测 贺晓龙张桂芝方维焕 浙江大学动物预防医学研究所，浙江省动物预防医学重点实验室 大肠杆菌0157：H7是一种以食物为主要传播途径的病原菌，大肠杆菌0157：H7感染的患者和 无症状携带者为主要的传染源，牛、羊、猪、鸡等动物是重要储存宿主…，感染主要经12传播，各 种肉类、牛奶、蔬菜、水果、饮料、水等均可成为传播媒介。其对人的致病力特强，摄入lo。．10。个 菌就会发病，而一般的大肠杆菌致病需菌10个以上。近年来国内局部地区发生0157：H7大肠杆菌 散发一1，更引起广泛关注。未能及时做出病原学诊断，疫情得不到及时控制，是导致暴发流行的 重要原因。因此建立敏感而特异的检测方法用于食品检验、暴发调查、监测与质量控制等领域就显 速诊断提供了实验依据。 1．材料与方法 。 E．coli0157：H7 1．1菌株 ATCC43889由上海交通大学严亚贤博士惠赠。E．coli 914，S．Orphimurium coli 10403s由本实验室保存；Escherichia83915，E,coli83901、83902 SLl344和三．monocytogenes 和83903菌株购自中国兽医药品监察所。 buffer等购于上海鼎国生物有限公司。蛋自酶K购子SIGMA公司。 试剂Taq-plus酶、dNTP、PCR L3引物设计 以E．coli 上海博亚(Bioasia)公司合成： WZX．1：5’CAGTCTTGGTGCTGCTCTGACA3’ TAG WZX-2：5’TGGTAGTCCCGCATG T1_rC3’ Fc．R：5’CAAAGCTGCAACGGTAAGTGA3’ G Fc．F：5’GTTGGTAGTGGTGTTGTTCAG3’ 1．4基因组DNA提取待检菌株在5ml 100II 离,心lmin，弃上清，沉淀用灭菌ddH20洗涤一次后用ddH，0 It 0．5％NaN,溶于pH8．0的Tris—HEl)100 冰上10皿in，12000rpm离一b5min，上清液即为DNA模板，一20℃保存或立即用于PCR扩增。 1．5 0．2mmol／L， PCR扩增二重PCR体系的总体积为30II1，其中包括：1XPCR反应缓冲液，dNTP 引物各25 II1DNA模板。优化后的PCR反应程序为94。C预变性5min， pmol／L，1．5UTaqplus聚合酶，5 增后的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察结果并拍照。 1．6二重PCR检测的敏感性 大肠杆菌0157：H7标准菌株在5mlLB中37℃过夜培养，取培养液lml 225 离心后弃上清，沉淀用灭菌0．1mol／L 比稀释至约10”CFU／ml，取各稀释度的菌液各Iml提取DNA模板，用于PCR检测。并做细菌平板计数。 1．7牛肉、猪肉、牛乳中大肠杆菌0157：H7人工污染的检测 板，进行二重PCR检测。同时对含不同稀释度的样品进行细菌平板计数。对牛乳样