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分子医学技能-实验二 PCR试剂盒检测HBV DNA apoB 基因检测 PCR基本原理及相关知识 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片断的技术,能在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。 Kary Mullis PCR技术最早由美国 Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的。 Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。 相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强 广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。 PCR扩增DNA片段的原理 PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步： ① 变性：加热，模板DNA形成两条单链 ② 退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合 ③ 延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物3-端向前延伸，合成与模板配对的新链 上述三步为一个循环，经过一个循环DNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后目的DNA就可以扩增106~109 倍。 通过循环可以提高PCR的特异性。 PCR反应体系的组成及功能 完整的PCR反应体系包括： 模板： 单、双链DNA均可，不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 引物 是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证 PCR特异性的关键因素，引物浓度：0.1-0.5 ?mol/L， 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 Taq DNA聚合酶 有良好的热稳定性，具有5‘-3’聚合酶活性和3‘-5’外切酶活性，因此。它对核苷酸的错配是没有校正功能。 其活性对Mg2+浓度非常敏感 终浓度一般为：2.5u/100ul，酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。 dNTP： 已有商品化的混合液，终浓度一般为20~200umol/L。 10×PCR反应buffer： 已作成商品化的产品，它包括： 250~500mmol/L KCl； 100~500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；15~20mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5~2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整。）； 0.1%明胶或牛血清白蛋白 dd H2O 调节反应体积 液体石蜡油 影响PCR的主要因素 ?PCR反应体系的各个组分 PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸） PCR循环的次数和平台效应 ?操作环境 平台效应及其原因 遗传多态现象(genetic polymorphism) 是指同一交配繁殖群体中存在两种或两种以上遗传变异的类型, 其中频率最低的类型并不依靠重复突变维持。 染色体多态现象 蛋白质多态现象 DNA多态现象 DNA多态现象产生的原因 单个核苷酸的点突变即核苷酸的替换 单一DNA序列的插入或缺失 整串DNA序列的插入或缺失 基因转换 DNA多态现象的类型 RFLP(restricted fragment length polymorphism) RAPD(random amplified polymorphic DNA) 微卫星多态性(microsatellite polymorphism) SSCP(single strand conformation polymorphism) DSCP(double strand conformation polymorphism) DNA芯片(DNA chips) DNA指纹 随机扩增多态性DNA标记(RAPD) 由Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致；由人工随机合成的DNA 分子为引物，以基因组DNA 为模板，进行多态性DNA片段的随机合成。对扩增产物进行电泳、染色分析，就可直接在紫外光线下看到新合成的DNA分子片段形成的不同条带。 遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基