四种邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性方法的比较.pdfVIP

2002年 11月 内蒙古大学学报(自然科学版) 第 3 3卷第 6期 Acta Scienfiarum Naturalium Universitatis NeiMongol NOV． 2002 VoI．33 No．6 文章编号 ：1OOO一1638(2002)06—0677—05 四种邻苯三酚 自氧化法 测定超氧化物歧化酶活性方法的比较’ 张 宏 ，谭 竹钧 (内蒙古大学生命科学学院 ，内蒙古 呼和浩特 010021) 摘要：邻苯三酚自氧化法(420 nm法)与邻苯三酚／DTT终止法测定SOD酶活力，结果基本一 致 ，其转换系数(CC)为 1．03；改进的邻苯三酚 自氧化法(325nm法)、微量邻苯三酚／Vc终止法 测定 SOD酶活力与 420nm法差别较大，其转换系数分别为 2．51、5．51．在测定 SOD酶活力 时，可根据不同的测定方法采用转换系数进行校正 ；实验表明；终止剂维生素 C(Vc)和二硫苏 糖醇 (DTT)对 SOD酶活力的测定无影响i325 nm法与 Vc法灵敏度较高 ，可用于 SOD活力较 低的样品． 关键词：超氧化物歧化酶；活性；邻苯三酚；自氧化 中图分类号 ：Q55 文献标识码：A 引 言 自1969年 McCord和 Fridovich。 首次从牛红细胞中分离出超氧化物歧化酶(Superoxide dismu— tase，缩写为 SOD，EC 1．15．1．1)以来，陆续在各种不同的生物组织都分离纯化出 SOD，并对 SOD 的物理 、化学、药理 、临床和作用机理等方面进行了广泛研究，建立了多种活力测定方法 ．国际上常 采用的有黄嘌呤氧化酶一NBT法、NBT还原法、肾上腺素自氧化法、细胞色素一C法和 Marklund邻 苯三酚 自氧化法。 ．目前 ，国内测定 SOD活力的方法多采用的邻苯三酚 自氧化法或其改 良的方法， 如 ：经典 Marklund邻苯三酚 自氧化法，简称 420 nm法 ；改进的邻苯三酚 自氧化法，简称 325nm法“ ； 微量邻苯三酚／Vc终止剂法 ；邻苯三酚／DTT终止剂法 等，都具有简便、快速等优点．但 由于 SOD 测定方法多样 ，活力规定不同，在 SOD的研究与生产中有诸多不便．本文对国内四种常用的 SOD测 定方法进行研究和比较 ，确定四种测定方法的转换关系及使用范围． 1 材料和方法 1．1 试剂与仪器 试剂 ：二甲砷酸钠 AR进 口分装，其它试剂均为 AR国产试剂，邻苯三酚经升华纯化 ，实验用水为 双蒸水 ． 样品：牛血 SOD，美国Sigma产品(纯度为 5O0O一10000U／mg)和本实验室采用热变性法制备的 牛血 CuZn—SOD纯 品 5OOO一10000U／mg． 仪器：岛津 UV一250紫外分光光度计(日本)，pH计(美国)，国产超级恒温水浴． 1．2 酶蛋白质浓度测定 按 Lowry法。 ，以 250gg／ml BSA作标准曲线． 1．3 酶活力测定 · 收稿 日期 ：2002—09—08 作者简介 ：张宏 (1962～)，男，上海人，实验师． 678 内蒙古大学学报(自然科学版) 1．3．1 Marklund邻苯三酚 自氧化法(简称 420nm法)见表 1 基本原理 ：在碱性条件下 ，邻苯三酚发生自氧化反应 ，生成有色物质红碚酚 ，同时产生 Oz，利用 SOD能分解 O’2的特性 ，阻止中间产物的积累，通过测定在特定波长下的光吸收速率计算酶的活 力，自氧化速率测定按表 1加入缓冲液，25土0．5℃ 恒温水浴保温 20 min，加入邻苯三酚 ，振荡器快速 混匀，置 1 cm 比色杯 ，以空白作对照 20 nnl波长下，每间隔 0．5 min打印一次 A值，连续记录 3 min， 自氧化速率 A。控制在 0．060(±0．001)／min．SOD活力测定 按表 1加样，同法记录 A值，通过调节 SOD样液浓度，使邻苯三酚氧化速率控制在 自氧化速率的 5O ，即 0．030(±O．001)／min． 1．3．2 改进的邻苯三酚 自氧化法(简称 325nm法)见表 2 自氧化速率测定 按表 2加入缓冲液 ，25±0．5℃恒温水浴保温 20min，加入邻苯三酚，振荡器混 匀，置 lcm 比色杯 ，以空白作对照 325nm 波长下 ，每间隔 0．5min打 印一次 A值 ，连续记录 3rain A 值，自氧化速率控制在 0．070(土O．002)／min．SOD活力测定 按表 1加样，同法记录 A值 ，通过调节 SOD样品浓度 ，使邻苯三酚氧化速率控制在 0．035(土0．002)／rain． pH 表 1 420nm法加样表 Table 1 protocol of the 420 nm operation 加 样 量(m1