Sirt1在肝癌及癌旁组织中的表达差异研究.pdfVIP

422 中国现代普通外科进展 2012 年 6 月 第 15 卷 第 6 期 with Hepatocellular carcinoma(HCC) and the tissues of 阴阳-HCC. The Si时 gene was identified and subjected to Real-time PCR analysis. Resulú The expression of Sirtl in tissues of HCC was ex- tremely higher than in tissues of para-HCC. The results of Real-time PCR were consistent with those of genechip analysis.εc_附eh阳?i tween tissues of HCC and par阳吕-斗HCC. Si内 1 may be associated with car陀ci川no旺旧【0】genesis of HCC. [KEY WORDS] Sirtl. Liver neoplasms.Oifferential expression 沉默信息调节因子 1 (silenl informalion regula- lor 1 , Sirt 1 )是烟瞰胶 (NAO)依赖的蛋白去乙M化 酶， Sirtl 属于 Sirtuin 家族，最初定义为 NAO依赖的 去乙院化酶家族，可使多种蛋白质的赖氨酸残基发 生去乙默化。 Sirtuin 是一类进化上高度保守的蛋白 质，参与了细胞内多种生物学事件的发生，尤其是 在细胞生存、寿命和物质代谢中具有重要作用IO Si时在生长调节、应激应答、肿瘤形成和内分泌信 号上有着广泛的生物学功能，同时能延长寿命。目 前，关于 Si时在肝癌的发生发展中是否发挥作用的 研究，国内外罕见相关报道。本研究应用基因芯片 技术，筛选肝癌组织与癌旁组织中的差异表达基 因.观察 Sirtl 及其相关基因的表达差异，以期进一 步深入研究肝癌的发病机制以及 Sirtl 在肝癌的发 生发展中所起到的生物学作用 3 1 材料和方法 1.1 材料及主要试剂 收集 2010 年 1 月二2011 年 l 月行手术切除治疗的肝癌患者 9 例，分别取各 例的肝癌组织及对应的癌旁组织;总 RNA 提取试 剂 (Trìzol)购自 Gìbeo 公司;内参磷酸甘油醒脱氢酶 (glyeeraldehyde phosphalc dehydrogcnase , GAPOH) Realtime PCR 引物由北京奥科生物技术有限公司合 成 ;SYBR Green 多聚酶链反应试剂购自 Takarama 公司。基因芯片由上海联合基因有限公司提供。 1.2 方法 1.2.1 组织总 RNA 提取及 mRNA 纯化按照 RNA 提取试开1]说明书操作，利用 Trizol 试剂一步法提取 肝癌患者的癌组织及对应癌旁组织的总 RNA，分光 光度计检测样品的吸光度值，然后进行热稳定实 验，分别于-20 c和 70 c保温 1 h 后，琼脂糖凝胶 电泳检测 28 S 、 18 S 条带变化 3 以 Qiagen 公司 Oligolex mRNA Midi Kil 纯化得 mRNA，操作按说明 书严格进行之 1.2.2 探针标记和芯片制备 逆转录标记 cONA 探 针并进行纯化c 以 Cy3-dLTP 标记癌旁组织 mRNA (5 问) ，以 Cy5-dUTP 标记肝癌组织 mRNA(5μgL 乙醇沉淀，在 20μL 5x拧镣酸饷 (SSC)+2 g/L 十二 烧基肌氨酸纳 (SOS)杂交液中进行济解。 芯片包含 20000 个 eONA ，包括原癌基因和抑癌基因、免疫调 节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、 信号转导相关基因等。通用引物进行 PCR 扩增， PCR 产物长度为 1000-30∞ bpo 靶基因溶解于 3x SSC j.容液中，用 Cartesian 7500 点样仪及硅烧化玻片 进行点样，玻片处理过程包括水合 2h、室温干燥 0.5 h 、UV 交联、用 2 g/L SOS 和水及 2 g/L 的棚氢化 纳溶液处理 10 min 、晾卡。 1.2.3 杂交及洗涤 基肉芯片和杂交探针 95 c水 浴变性 5 min 后，将混合探针加于基因芯片上，60 c 杂交 15-17 h ，SSC 及 SOS j昆合液洗涤lO min，晾于。 1.2.4墓因芯片的筛选结果判定 以 General Scanning 公司的 ScanArray 3000 扫描芯片预先选定