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第3章:病毒感染力的滴定
第三章 病毒感染力的滴定;半数致死量LD50(50% lethal dose)
半数鸡胚感染量EID50 (egg 50% infective dose)
半数细胞培养物感染量TCID50(tissue culture 50% infective dose)
蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU);一、病毒TCID50的测定
操作步骤;设正常细胞对照,正常细胞对照作两纵排。
逐日观察并记录结果,一般需要观察5-7天。
结果的计算,按Reed-Muench两氏法或Karber法;TCID50的计算方法;Calculation of TCID50;病毒液 CPE孔数 无CPE 累 计 出现CPE孔
稀释度 孔数 CPE孔数 无CPE孔数 所占的%
10-1 8 0 27 0 100(27/27)
10 -2 8 0 19 0 100(19/19)
10 -3 7 1 11 1 91.6 (11/12)
10 -4 3 5 4 6 40(4/10)
10 -5 1 7 1 13 0.7(1/14)
10 -6 0 8 0 21 0(0/21)?;距离比例=(高于50%病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数)
=(91.6-50)/(91.6-40)
= 0.8;lgTCID50=距离此例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
=0.8×(-1)+(-3)
=-3.8
TCID50=10-3.8/0.1ml;Karber法 ;lgTCID50=L-d(s-0.5)
L: 最高稀释度的对数
D:稀释度对数之间的差
S:阳性孔比率总和
lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)
=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml ;二、病毒蚀斑技术
病毒蚀斑(plaque)
又称空斑,指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。;原理:适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感细胞后,在覆盖的固体或半固体介质(琼脂糖、甲基纤维素)的作用下,病毒在最初感染的细胞内增殖后,只能进而感染并破坏临近的细胞,经过几个增殖周期后,形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区,即局限性的病灶。;Procedures;操作步骤;将培养板置37℃ 5% CO2培养箱吸附1h,吸弃病毒液,用含钙、镁的PBS(pH7.4)洗3次。
取1.6%-2%的低熔点琼脂糖,??化后降温至38-42℃,与等量预热至38-42℃含6%-10%犊牛血清的无酚红DMEM混合,注入细胞培养板中。;室温放置直至琼脂糖凝固,或于4℃冰箱放置几分钟至琼脂糖凝固,然后于37℃ 5% CO2培养箱继续培养。
每天于显微镜下观察细胞病变情况。
出现空斑后(2-3天),用含钙、镁的PBS将0.1%的中性红贮存液10倍稀释后滴加到细胞培养板上。
于37℃ 5% CO2培养箱中作用1h,吸弃染液,继续于温箱中培养2-3h。;TK-突变株与野毒形成的空斑的比较;如果是测定PFU,则直接记取一定稀释度的病毒所形成的空斑数,然后根据公式计算PFU。
如果是作病毒纯化 ;一般的毒种纯化:收集病变的细胞悬液,测定TCID50,然后选TCID50较高者再作几轮空斑纯化,获得高滴度的病毒,扩大培养后作种用。
筛选重组病毒:收集病变的细胞或病毒悬液,通过PCR或其它方法进行鉴定,取阳性者再作下
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