16SrDNA基因文库技术分析发酵床细菌群落的多样性.pdfVIP

第26卷第1期，201 3年1川 、bl 26NO 1．Jan 2013 宁 波 大学 学 报 (理 ：I：版 ) JOURNAL OF NINGBO UNIVERS1TY(NSEE) ‘』l=I； p14高校优秀科技期 奖 浙汀省优秀科技期刊 ‘等奖 1 6S rDNA基因文库技术分析发酵床细菌群落的多样性 毕泗伟 ，吴祖芳 ，虞耀土 (1．宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 31521 1； 2．宁波市余姚河姆渡镇农业经济办公窀，浙汀 宁波 3 1 54]4) 摘要：细菌群落在养殖发酵床中担负着重要的调节与废物发酵转化作用．直接从不同发酵床层 次样品中提取细菌总 DNA，构建发酵床不同层次垫料的细菌基因克隆文库．试验表明，发酵床 表层45株细菌中未培养微生物占39．5％，剩余细菌分属13个不同种，优势菌不明显；中层发酵床垫 料 45株细菌中未培养微生物占 15．5％，剩余细菌分属 10个不同种，优势细菌为 Rhodanobacter sp． 和 Frateuria sp．；深层发酵床垫料中检测到的 44株细菌不合未培养微生物，该层细菌主要有 14 个不同的种，优势细菌为 Rhodanobacter sp．占47．7％，其余种属相对较少且数量平均，表明发酵 床垫料细菌呈明显的多样性． 关键词：发酵床：细菌群落：16S rDNA基因文库；微生物多样性 中图分类号：O938．1 文献标志码：A 文章编号：l001—51 32(20l3)01—0()l8—05 发酵床养殖技术是一种利用复合菌剂原地转 化畜禽养殖废物的新型养殖技术，广泛应用于生 猪、牛以及禽类养殖中l】]．发酵床养殖技术能针对 性解决养殖环节中的污染问题，在山东、福建等省 的养殖区 得到应用．其主要特点是人工成本低、 无二次污染l2J．但 目前国1人J的发酵床菌剂无针对 性 、且良莠不齐，阻碍了该技术大面积的推广_j1． 自然界LlJ 99％的微生物都不能在实验室培养l4J，传 统微生物纯培养不能反映自然样品中微生物的丰 度，而近年来分子技术的发展给微生态学研究提 供了新的途径l5f．基因文库技术能较全面地呈现 自 然状态下样品Lf|微生物的活性，包括大部分的未 培养微生物_(1J．基l犬J文库技术已被广泛地应用于石 油污染水域【 J、制药污水【 、温泉土壤[圳、果园十 m 以及动物肠道 12-]3]等复杂的微生物环境中． 笔者通过建立正常运转发酵床内不 层次的 细菌基I大j文库，对该环境下的主要作用细菌进行 多样性分析，为研制高效专一的生猪养殖发酵床 菌剂提供参考． 1 材料与方法 I．1材料 生猪养殖发酵垫料，取白余姚市河姆渡，Ij念 养殖场(使用市售发酵菌剂，主要山枯草芽孢卡F蔺 、 光合细菌、乳酸菌等组成)．在H一猪 1人J以 “z” 字形 5点取样，深度分别为 1 0～l 5 cm、30～35 C11、 50～55 cm，混合均匀后作为3个试验样本，分别乃 表层、L}j层和深层样本． 主要试剂：土壤 DNA提取试刹盒(Fast DNA SPIN kit for soil)， 于 MP Bion~edicals公I ：凝胶 LⅡJ收试剂盒，购’j 上海生工牛物 1： 有限公州：限 制性内切酶，{『!l!』于上海生工生物 工程柯限公 ： PMDl8一T载体，购于 Takara公司；平板汁数培养 基、乳糖胆盐发酵管、改良高氏培养基、麦芽汁培 养基、MRS培养基和LB培养基等． 主要仪器和设备：PCR 仪(Mastercycler pro)， 购于 Eppendorf公刖：恒温恒湿培养箱(HWS一4301 购 j：宁波江南仪器厂． 收稿日期：2012—10-06 宁波大学学报 (理lT版 )l叫址：htp：／／nbdxlg paperopen corn／ 基金项目：宁波Ji农业攻关项目 (20IOC10058) 第一作者：毕沁伟 (I 986一)，女，山东莱芜人，在读硕1=研究生，主要研究方 微生物与资源利 E-mail：siweibi㈣yahoo c【1 通信作者：吴祖芳 (1963一)，男，浙江奉化人，博士／教授，主要研究方 微生物应州技术．E-mail：wuzufang06@yahoo COlI1 cn 第 1期 毕泗伟，等：应用 16S rDNA基因文库技术分析生猪养殖发酵床细菌群落的多样性 19 1．2 方 法 1．2．1传统培养技术分析发酵床垫料微生物 用梯度稀释法将3样本分别稀释，选择3个浓 度梯度取 0．1 mL稀释液涂布法接种于平板计数培 养基上，每个浓度梯度 2个平行，36℃培养 48h， 计细菌总数；同上，取适宜浓度分别接种于取乳酸 胆盐发酵管、麦芽汁培养基、改良高氏培养基和 MRS培养基中，分别