靶向HER2 mRNA反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究的论文.docVIP

　　靶向HER2 mRNA反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究的论文 【摘要】 目的 研究以her2 mrna为靶点的反义硫代脱氧寡核苷酸（sodns）ha6722对her2过表达乳腺癌细胞株mdamb453体外增殖的抑制作用，及ha6722对肿瘤细胞her2表达的影响。方法 选择her2过表达的mdamb453细胞与her2低表达的mdamb231细胞，mtt法观察sodns对肿瘤细胞增殖的影响，免疫细胞化学（icc）与rtpcr方法研究sodns对细胞her2蛋白及mrna表达的影响。结果 ha6722可以剂量依赖方式抑制mdamb453细胞的体外增殖，ic50值（41.8±8.1nmol·l-1, n=5, mean±s）显著低于对照序列scramble6722（ic50=489.4±12.1nmol·l-1, n=5, plt;0.01）。ha6722在蛋白水平与mrna水平显著抑制mdamb453细胞中her2的表达；ha6722对mdamb231细胞的体外增殖无显著影响（ic50=476.7±17.6 nmol·l-1, n=5，p＞0.05）。结论 ha6722可序列特异性地抑制her2过表达乳腺癌细胞的体外增殖，其抑制增殖作用与靶细胞her2表达下调有关。 【关键词】 反义 寡核苷酸 乳腺癌 her2 mrna 0 引言 乳腺癌的发生、发展涉及多基因的异常。her2/neu（又称cerbb2）基因的异常扩增见于30%左右的乳腺癌患者。.现已明确，her2/neu基因的异常扩增或her2受体的过表达是一种不良的预后指标[1]。反义疗法是在转录水平以反义寡核苷酸特异性结合靶mrna，激活rnase h，降解mrna, 阻断相应功能蛋白的表达。有研究表明[2，3], 反义寡核苷酸可以抑制her2受体的表达，进而抑制乳腺癌细胞的增殖。本研究采用本研究室设计合成的her2特异性硫代反义寡核苷酸ha6722，观察了其对不同her2表达水平的乳腺癌细胞株增殖活性的影响，并在mrna和蛋白水平观察了其对her2的影响。 1 材料与方法 1．1 细胞系及培养 本研究采用的细胞株有：mdamb453（her2过表达），细胞培养所需的培养基为l15（gibco,brl）内含10%的胎牛血清（fcs，hyclone），置37℃、不含co2的培养箱中培养；mdamb231（her2低表达）的体外培养采用rpmi1640（gibco,brl）培养基，内含10%的胎牛血清（fcs，hyclone）,置37℃、含体积分数为5%的co2培养箱中培养传代。 1．2 硫代反义寡核苷酸的合成 靶向her2 mrna反义寡核苷酸ha6722、scramble6722序列均为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下： ha6722： 5′cag cag ccg agc cag ccc ga3′ scramble: 5′tcg ggc tgg ctc ggc tgc tg3′ 琼脂糖凝胶电泳结果表明上述反义寡核苷酸纯度符合要求。上述反义寡核苷酸以无血清无抗生素的l15或rpmi1640培养基溶解成浓度为25μmol·l－1的溶液，过滤除菌，-20℃储存，临用时稀释至所需浓度。 1．3 噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium, mtt）法检测细胞活性 取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板（costar,usa）,接种数量分别为：mdamb453 5×104cells/孔、mdamb231 2×104cells/孔，为避免“周边效应”，培养板的周边孔弃用。待细胞生长至80%～90%融合时，用脂质体2 000将不同浓度的ha6722, scramble6722等硫代寡核苷酸转染细胞4～6h，随后继续培养24～72h，倾去培养液，加新鲜配置的mtt溶液（0.5mg/ml）200μl, 细胞在37℃，含有5 %（mdamb453细胞的培养不需co2）的培养箱中继续孵育4h，吸去mtt溶液，每孔加200μl dmso, 轻轻震荡20～30min，酶联仪测定光吸收值（od值）。 1．4 免疫细胞化学 以脂质体（lipofectamim 2000, invitrogen）2000将终浓度为200 nm 的ha6722, scramble6722对照序列转染mdamb453及mdamb231 36h后，以免疫组化方法检测her2受体表达。具体方法见免疫组化试剂盒操作说明（中山公司）。简言之，将细胞涂片在枸橼酸缓冲液(6.4m枸橼酸二钠，ph 6.0)中以 95℃ 15min进行抗原修复