靶向survivin siRNA与5Fu协同抑制MCF7细胞增殖的论文.docVIP

　　靶向survivin siRNA与5Fu协同抑制MCF7细胞增殖的论文 【摘要】 目的 研究以survivin为靶标的小干扰rna（sirna）与化疗药5fu联合应用抑制mcf7细胞增殖的作用。方法 以脂质体为载体，将survivin sirna转染至mcf7细胞中，用四氮唑盐（mtt）法染色并计算sirna联用5fu对mcf7细胞的抑制率，用sas统计软件及金正均q值法进行统计分析。结果 单用5fu，ic50为4.42μg/ml；加入5nmol/l sirna后，ic50降为1.18μg/ml；sirna与5fu联用的抑制作用较单用5fu强（f=26.74，p＜0.01)；q值分析表明survivin sirna与中低浓度的5fu联用，有较好的协同作用（q≥1.15）。结论 survivin sirna与5fu联用，可显著增强对mcf7细胞增殖的抑制,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。 【关键词】 rna干扰 化学疗法 联合治 mcf7 目前化疗存在两个主要缺点,一是化疗药物对正常细胞的毒性,二是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。本研究通过rna干扰技术靶向抑制调节细胞凋亡的survivin基因的表达，旨在研究survivin sirna诱导乳腺癌细胞mcf7凋亡和提高其对常用抗肿瘤药物敏感性的作用，探讨survivin基因用于肿瘤基因治疗的可能性。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 lipofectamim2000购自美国invitrogen公司，四氮唑盐（mts）购自美国promega公司，5氟尿嘧啶（5fu）购自天津人民制药厂（生产批号：0204242）。.cOm 1.2 细胞培养 mcf7细胞组织来源为人乳腺癌,上皮样贴壁生长，购于北京大学医学部分子生物中心。3天左右传代一次,0.25%胰蛋白酶消化,新鲜配制含 10%胎牛血清的prmi1640培养基在37℃、5% co2及饱和湿度环境下培养。 1.3 survivin sirna的制备 根据elbashir等[1]确定的sirna的特点，利用t7rna聚合酶体外转录合成sirna的方法[2]，筛选出了一条rna干扰survivin基因的靶序列。这条序列通过计算机经blast检索证明与survivin以外的人类基因无同源性。 survivin target mrna 5′ gtctggcgtaagatgatgg 3′ sirna 5′ gucuggcguaagaugaugguu3′sene strand 3′ uucagaccgcauucuacuacc5′antisense strand1.4 联合用药体外抗肿瘤活性测定 在96孔细胞培养板中，每孔加入含4×103个mcf7细胞的100μl培养液，置37℃、5％co2孵箱培养24h。在无血清无双抗状态下，用脂质体lipofectintm2000，按其说明书进行sirna的转染，sirna的最终浓度为5nm。 转染6h后，换含不同浓度5fu的培养液100μl。化疗药物5fu取其ic50上下的5个浓度（ic50为5fu对经脂质体处理后的mcf7细胞的半数致死剂量）（5fu：1.25、2.5、5、10、20μg/ml）分别与sirna相组合，每种浓度组合重复4孔，以单用sirna及单用5fu（预先经脂质体处理）作为单药对照组，以经脂质体处理后不加药组作为空白对照。继续培养48h后，每孔加20μl mts，置于37℃、5％co2孵箱90min后，用多功能酶标仪测定吸光度a490nm，并计算细胞增殖抑制率i。 i%=（a对照-a测定）/（a对照-a空白）×100% 1．5 统计学方法 采用sas统计软件进行析因分析。 1．6 协同作用分析方法 评价联合用药对肿瘤细胞的抑制是否有协同作用，参照文献[3，4]以金正均q值法判断：q=ea+b/(ea+eb-ea×eb)，其中ea+b为合并用药的抑制率，ea和eb分别为a药和b药单独用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母是“期望合并效应”，q是两者之比。q＜0.85为拮抗，0.85≤q＜1.15为相加，q≥1.15为协同。 2 结果 2．1 联合用药对mcf7细胞增殖的抑制 图1表明，单用5fu，ic50为4.42μg/ml；加入5nmol/l sirna后，ic50降为1.18μg/ml。上述结果说明在化疗药物中加入survivin sirna后，药物对mcf7的抑制效果均有明显增加，并且可以看出随着化疗药物浓度的增加，抑制率增高的趋势均逐渐变缓。 2.2 对化疗药物5fu与sirna联用进行析因设计的方差分析 采用sas统计软件对以上数据进行分析，sirna+5fu的f