变性高效液相色谱进行HLA.docVIP

　　变性高效液相色谱进行HLA 作者：王静波　李丹　潘凯枫　陆道培 【摘要】 　　为了探讨通过变性高效液相色谱（DHPLC）进行HLA-DRB1配型的可行性， 选择经PCR-SSP证实的20例HLA-DRB1相合及2例HLA-DRB1不相合的病人及其同胞供者的标本为实验对象，全部标本通过PCR扩增HLA-DRB1第二外显子基因片段，PCR产物经梯度变性处理后通过DHPLC检测，在部分变性温度下，检测病人与供者的HLA-DRB1第二外显子DHPLC峰型是否相同，以判断供受者的HLA-DRB1基因型是否相同。结果表明： DHPLC与PCR-SSP进行DRB1配型比较 分析 , 经kappa检验，kappa值为0.776， P值＝0.00， 说明两种 方法 的配型结果无显著性差别。结论： 变性高效液相色谱方法用于HLA-DRB1配型方便, 经济 实用并解决了HLA新基因的不断出现与相应的位点的引物或探针设计和开发的相对滞后之间的矛盾。 【关键词】 DHPLC HLA-DRB1配型 PCR-SSP 　　Feasibility of HLA-DRB1 Matching by Using DHPLC 　　AbstractTo study feasibility of HLA-DRB1 matching by using denatured high performance liquid chromatography （DHPLC）， 20 pairs of DNA samples from donors and recipients of hematopoietic cell transplantation (HCT) for DRB1 matching and 2 pairs of samples from donors and recipient of HCT for DRB1 mismatching plified and annealed sloatched or mismatched peaks in chromatogram. The results shoatched or mismatched HLA-DRB1 typing. The results of DHPLC and PCR-SSP for matching atching ent atching is economic and convenient, moreover, atching; PCR-SSP 　　变性高效液相色谱（DHPLC）是一种新型的检测基因的多态性的方法［1］。这种方法是根据含有异源双链的PCR产物中不匹配碱基的种类，数量及排列顺序以及位置的差异产生不同的的DHPLC峰型，从而推测目的基因的多态性。由于HLA-DRB1片段的高度多态性，每一个等位基因的多态碱基的种类，数量及位置均不相同，其DHPLC峰型也应该不同。通过DHPLC进行供受者样本的基因型的直接比对，如果供受者的HLA基因型相同，则其DHPLC峰型也应该相同。反之，则DHPLC峰型不相同，从而达到判断供受者HLA配型是否相合的目的。编码HLA-DRB1抗原多态性的基因主要在HLA-DRB1第二外显子［2］，因此我们的 研究 重点主要在HLA-DRB1的外显子2。 　　材料和方法 　　标本来源 　　22对病人及其同胞供者标本均来自北京大学人民 医院 血液病研究所。 　　DNA提取 　　取抗凝血5 ml， 525×g离心10分钟。吸出白细胞层，加入红细胞裂解液10 ml，室温放置20分钟， 365×g离心10分钟，弃上清，重复2次，然后加入白细胞裂解液3 ml，蛋白酶K（10 mg/ml）75 μl、10% SDS 200 μl、37℃过夜后加入6 mol/L氯化钠1 ml震摇15秒，充分混合后置4℃冰箱20分钟， 2 220×g离心20分钟，将上清液移至另一试管，加入等体积无水乙醇，封口倒转试管数次至絮状物折出，将絮状物移至1 ml EP管中，加入75%乙醇0.8 ml，16 210×g离心1分钟，重复2次，弃上清，室温干燥30分钟，加入300 μl TE溶液，DNA溶解后进行定量。 　　PCR 　　PCR扩增HLA-RB1外显子2引物为5GGAGGCCGCCTGTGTGACTG3, 5CCCAGCTCACAGGGACTCAGG3。扩增片段为353 bp, 25μl PCR体系包括： 50 ng基因组DNA,0.2 μmol/L引物,200 μmol/L dNTP，2 U pfu，2 mmol/L氯化镁。扩增条件为94℃ 4分钟, 94℃ 45秒，72℃ 1分钟20秒，35个循环，72℃延伸10分钟。 　　DRB1的DHPLC分型及比对 　　PCR产物经过95℃ 3分钟变性，然