同型半胱氨酸对ECV304细胞NFκB活性的影响及金雀异黄酮的保护机制.docVIP

　　同型半胱氨酸对ECV304细胞NFκB活性的影响及金雀异黄酮的保护机制 【摘要】 　　目的 检测同型半胱氨酸(HCY)对人脐静脉内皮细胞株ECV304的损伤对细胞核因子(NFκB)活化的影响及金雀异黄酮（GEN)的保护作用。方法 以5.0 mmol/ L的HCY作用于ECV304细胞：设不同浓度的GEN（10、50、100 μmol/L）保护组孵育12 h后，再加入5.0 mmol/L的HCY，通过四噻氮唑盐（MTT）比色法观察细胞活性，通过ethods MTT assay munohistochemistry. Results The cellular viability of 5.0 mmol/ L HCY 〔(41.27±5.09)%〕 ent of 5.0 mmol/L HCY and different concentration GEN（10, 50, 100 μmol/L）, the cellular viability of each group had elevated and the expression of NFκB decreased. Conclusions HCY can lead to endothelial dysfunction in ECV304 by increasing the activity of NFκB. GEN can protect the cell viability and decrease the expression of NFκB. 【Key ocysteine；ECV304 cells；NFκB 　　动脉粥样硬化(AS）是一类严重危害人类健康的心血管疾病，其发生 发展 与多种因素有关。同型半胱氨酸(HCY)属含硫氨基酸，体内不能合成，能够引起内皮细胞功能紊乱〔1〕。大量实验证明，HCY是导致AS的独立的危险因素。金雀异黄酮(GEN)，可以改善血管内皮功能〔2〕,可以抑制HCY诱导的炎症损伤,抑制内皮细胞与白细胞/血小板等黏附〔3〕,具有防止早期AS等多种药理作用及生物活性。本研究通过观察HCY对ECV304血管内皮细胞刺激的细胞核因子NFκB的影响，同时观察GEN的保护作用，旨在探讨HCY致AS的机制以及GEN的保护作用，为其应用于临床 治疗 AS提供 科学 的理论依据。 　　 1 材料与方法 　　1.1 主要试剂 　　人脐静脉内皮细胞株ECV304（武汉大学 中国 生物典藏中心）；HCY、GEN、DMSO均购于Sigma公司；四甲基噻唑氮蓝(MTT) 购于Fluka公司；鼠抗人NFκB p65抗体、羊抗鼠IgG、βactin抗体购于Santa Cruz公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 ECV304细胞培养 　　人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞接种于含10%灭活小牛血清的新鲜RPMI 1640培养液中，置37℃、5% CO2培养箱中。所有实验操作均采用对数生长期的细胞。 　　1.2.2 实验处理 　　HCY用无血清1640培养液混匀，GEN用DMSO溶解，实验分为5组，正常对照组；HCY 5.0 mmol/L组；GEN 10 μmol/L+ HCY 5.0 mmol/L组；GEN 50 μmol/L+ HCY 5.0 mmol/L组；GEN 100 μmol/L+ HCY 5.0 mmol/L组。对照组加不含任何药物的培养液100 μl ，每组设4个复孔。 　　1.2.3 MTT法检测细胞生长情况 　　参照Tada测定细胞活性的改良法〔4〕，消化细胞调整浓度至4×104 ml-1，接种于96孔培养板，每孔100 μl，培养过夜，细胞贴壁生长，80％融合时，吸弃原培养液。实验组预先加入终浓度为0、10、50、100 μmol/L的GEN孵育12 h，再分别加入终浓度为5.0 mmol/L HCY的RPMI 1640培养液100 μl，对照组加不含任何药物的培养液100 μl，每组设4个复孔；同时设空白对照（只有培养液，无细胞）。继续培养48 h。上述每孔分别加入20 μl MTT (5 mg/ ml)，置5%CO2 37 ℃孵育 4 h后，加三联溶解液每孔100 μl (10% SDS+5%异丁醇+0.012 mol/L的HCl)，二氧化碳培养箱中继续培养14 h，镜下观察甲臜结晶全部溶解后，以空白孔调零，酶标仪检测570 nm处的吸光度值(A570)。细胞活力(%) = 实验孔A570值/对照孔A570值×100%。 　　1.2.4 SDSPAGE电泳及l，4℃离心，500 r/min，3 min收集细胞，提取的胞浆蛋白和核蛋白用考马斯亮兰法（Braford法）进行蛋白定量。12％聚丙烯酰胺凝胶电泳