蛋白激酶Cα在兔自体移植静脉中的表达.docVIP

　　蛋白激酶Cα在兔自体移植静脉中的表达 作者：蔡方刚， 吴捷， 詹腾辉， 郭平凡 【摘要】 目的 观察蛋白激酶Cα(PKCα)在兔自体静脉移植中的动态表达，探讨其与移植血管内膜增生的关系。 方法 采用兔自体颈静脉移植模型，25只新西兰大白兔随机分为5组，其中手术Ⅰ～Ⅳ组分别于术后3，7，14，28 d取材，假手术组(SO组)作为对照组。应用RealTime PCR法、RNA及其蛋白的表达变化；应用免疫组织化学法检测各组平滑肌细胞中PKCα的表达。 结果 与对照组比较，PKCα mRNA及其蛋白在术后3 d时，表达均明显升高（Plt;0.01），而后逐渐降至正常。免疫组织化学检测PKCα结果与g/kg），剪毛，消毒，固定于手术台并铺巾。取颈正中切口，游离出右侧颈外静脉及左颈总动脉，在颈总动脉的上、下两端用无创动脉夹阻断血流后，横断血管，取右侧颈外静脉约2.0 cm置于对侧颈总动脉两断端之间，以90缝线采用间断外翻法行端端吻合，每个吻合口缝12针。检查无出血及吻合口漏血后即缝合伤口。麻醉时及术毕腹腔各注射青霉素8×105 U，术后皮下注射肝素6 250 U。 1.2.2 收集血管标本 手术组分别于移植后第3,7,14,21天行动物麻醉后，打开原切口，切取搏动良好的移植桥，对照组直接切取颈静脉。标本一部分用中性福尔马林固定，备行HE染色与免疫组织化学检查，一部分置于液氮内，备行PCR与e PCR检测PKCα mRNA表达 取冻存的标本按下列方法检测：(1)总RNA抽提：用Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），按说明书介绍的方法，提取RNA，用分光光度计测D260/D280值。（2）cDNA的制备：采用Promega公司的反转录试剂盒按说明书合成cDNA。（3）引物序列：设置βactin为内参照，根据Genebank设计引物。 PKCα： 上游：5’CCAGCATCTCATACAGCAGGAC3’ 下游：5’AGTTCAAGGAGCCACAAGCAGT3’ βactin： 上游：5’GGGCCGGACTCGTCATACT3’ 下游：5’CCTGGCACCCAGCACAAT3’ 引物由美国Invitrogen公司合成。（4）RealTime PCR扩增：反应在TP800荧光定量PCR仪（日本TaKaRa公司）上进行。体系为cDNA 2.0 μL，PKCα、βactin特异上下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL（日本TaKaRa公司），去离子水补至25 μL。PCR循环条件为：95 ℃ 2 min→94 ℃ 10 s→60 ℃ 30 s，40个循环后进行熔解曲线的测定。（5）RealTime PCR的数据处理：数据分析按照 2 结 果 2.1 移植后血管形态学观察 光镜下见正常静脉内膜被覆单层内皮细胞，中膜薄，由2～3层平滑肌细胞及少量结缔组织组成。移植后3 d可见内膜受损，有炎性细胞浸润，移植后1周可见明显内膜增生，随着时间的延长，在移植后的14，28 d渐见内膜增厚，有较多层的平滑肌细胞，血管管腔相对变小。 2.2 PKCα mRNA表达 在移植后的第3天，mRNA的相对表达量明显升高，约为对照组的（2.335±0.059）倍，2组间差别有统计学意义（Plt;0.01）。随着时间的延长，其表达量渐减少（图1）。 2.3 PKCα蛋白表达 2.3.1 C）增生有关，在VSMC增生过程中，细胞表型发生改变，细胞增殖、迁移并产生大量的细胞外基质，导致新生内膜的形成、管腔的狭窄[4]。VSMC的增生涉及到一系列的细胞信号转导过程，而PKC作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶，与细胞胞内的多种信号转导过程有关。 PKCα作为PKC传统型同工酶中的一种，存在于生物体的大多数血管组织内[5]。既往的研究发现，PKCα在人类大隐静脉细胞的增生过程中起着重要的作用[6]。研究还发现，PKCα可通过促进胞内的原癌基因sis及cfos等的表达、诱导cmyc基因表达使胞内DNA合成加快、激活MAPK途径等多种方式促进血管平滑肌细胞增生[710]。在本实验中，笔者应用兔的颈静脉移植模型，检测移植后静脉组织内的PKCα表达变化，结果显示，在静脉移植后的早期，PKCα mRNA及其蛋白表达升高，而后渐降至正常，其表达定位于增生的平滑肌细胞中。这表明PKCα可能参与了VSMC增生的初始过程的信号转导。 移植静脉内的PKCα增高可能与移植后的静脉内膜受到损伤而导致一系列的变化有关。研究表明，静脉移植后，因血流的压力变化可引起血管内膜上的内皮细胞的损伤，导致了血小板粘附与浸润。活化的血小板分泌许多炎症性