大蒜素对肺癌耐紫杉醇细胞株A549Taxol生长抑制的实验研究.doc

大蒜素对肺癌耐紫杉醇细胞株A549/Taxol生长抑制的实验研究 作者：王浩等 [摘要] 目的 研究大蒜素对耐紫杉醇人肺腺癌A549/Taxol细胞增殖及凋亡的影响。 方法 采用CCK8法检测不同浓度大蒜素及大蒜素与紫杉醇联合应用后对A549/Taxol细胞增殖抑制率及紫杉醇IC50值。ELISA法测定细胞上清液缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）与血管内皮生长因子（VEGF）水平，比色法检测caspase-3、caspase-8活性变化。 结果 大蒜素对A549/Taxol细胞增殖有明显抑制作用（P0.05），两药联合后紫杉醇IC50由861.61 μg/ml下降至149.02 μg/ml；随大蒜素浓度增加，A549/Taxol细胞上清液HIF-1α与VEGF水平呈下降趋势，caspase-8、caspase-3蛋白活化增加。 结论 大蒜素能显著抑制A549/Taxol细胞增殖、诱导其凋亡，可能与HIF-1α及VEGF表达下降及caspase-8、caspase-3激活相关。 　　[关键词] 大蒜素；A549/Taxol细胞；耐药；紫杉醇 　　[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）09（c）-0013-03 　　肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率仅为13%～16%[1]。紫杉醇是肺癌治疗的一线化疗药物。但肺癌细胞对紫杉醇耐药常导致治疗失败。研究证实，大蒜素对肺癌等多种肿瘤均有显著的抗癌作用[2-3]，但其对耐药细胞影响的研究甚少。本文旨在观察大蒜素对体外培养耐紫杉醇细胞株A549/Taxol的生长抑制作用并探讨其作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂及材料 　　大蒜素注射液为上海禾丰制药有限公司产品（批号为121208）；紫杉醇注射液为扬子江药业产品（批号为110 910）；Cell Counting Kit-8购自日本同仁化学研究所；HIF-1α与VEGF ELISA检测试剂盒购自南京凯基生物公司；caspase-3、caspase-8活性检测试剂盒购自碧云天生物公司。 　　1.2 细胞培养 　　A549/Taxol细胞由南京凯基生物公司提供，用含10%小牛血清及100 μg/ml紫杉醇的RPMI1640培养液于37℃，5%二氧化碳及饱和湿度的培养箱培养，胰酶消化法传代培养，每周2～3次。 　　1.3 CCK8法分别检测大蒜素及紫杉醇对A549/Taxol细胞增殖的影响 　　取对数生长期A549/Taxol细胞，调整细胞密度1.0×105个/ml，取100 μl接种于96孔板培养，细胞进入对数生长期后依次加入大蒜素终浓度为0、20、40、60、80 μg/ml的RPMI1640培养基100 μl；同法配置紫杉醇，终浓度分别为0、10、100、1000、2000 μg/ml，每组设5个复孔，孵育72 h，每孔加入CCK8检测液10 μl，酶标仪测定450 nm波长各孔OD值，计算细胞抑制率及IC50值。抑制率=（1-加药组A值/对照组A值）×100%。 　　1.4 两药联合应用对紫杉醇IC50值的影响 　　根据1.3实验结果，向96孔板培养的A549/Taxol细胞中加入IC50值的大蒜素作用24 h后，更换终浓度分别为0、10、100、1000、2000 μg/ml的紫杉醇溶液，培养72 h，观察两药联合培养后A549/Taxol细胞紫杉醇IC50变化。 　　1.5 ELISA检测细胞上清液HIF-1α与VEGF含量 　　取对数生长期A549/Taxol细胞，调整细胞密度2.0×104个/ml，取3 ml接种于24孔培养板，细胞进入对数生长期，依次加入大蒜素终浓度为0、40、80 μg/ml的RPMI1640培养，孵育72 h后收集细胞上清液，BCA法检测蛋白浓度，根据ELISA试剂盒说明分别测定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）与血管内皮生长因子（VEGF）蛋白浓度。 　　1.6比色法检测caspase-3、caspase-8活性 　　取对数生长期A549/Taxol细胞，调整细胞密度1.0×105个/ml，取5 ml接种于6孔培养板，细胞进入对数生长期，依次加入大蒜素终浓度为0、40、80 μg/ml的RPMI1640培养，孵育72 h后收集细胞并提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取30 μg蛋白分别加入caspase-3、caspase-8检测液，每组设，4个复孔，37℃孵育1.5 h，酶标仪检测405 nm波长各孔OD值，依据标准曲线计算caspase-3、caspase-8活性单位。 　　1.7统计学分析 　　采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，以