A New Generation of T7 RNA Polymerase-Independent Inducible Expression Plasmids for Trypanosoma brucei 英文参考文献.docVIP

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2017-05-11 发布于上海
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A New Generation of T7 RNA Polymerase-Independent Inducible Expression Plasmids for Trypanosoma brucei 英文参考文献

ANewGenerationofT7RNAPolymerase-Independent InducibleExpressionPlasmidsforTrypanosomabrucei JackSunter1,BillWickstead2,3,KeithGull3,MarkCarrington1* 1DepartmentofBiochemistry,UniversityofCambridge,Cambridge,UnitedKingdom,2CentreforGeneticsandGenomics,UniversityofNottingham,Nottingham,United Kingdom,3SirWilliamDunnSchoolofPathology,UniversityofOxford,Oxford,UnitedKingdom Abstract ExpressionoftransgenesiscentraltoforwardandreversegeneticanalysisinTrypanosomabrucei.Theinducibleexpression of transgenes in trypanosomes is based on the tetracycline repressor binding to a tetracycline operator to prevent transcriptionintheabsenceoftetracycline.Thesameinduciblesystemisusedtoproducedouble-strandedRNAforRNAi knockdown of target genes. This study describes a new plasmid pSPR2.1 that drives consistent high-level expression of tetracyclinerepressorinprocyclicformtrypanosomes.Acomplementaryexpressionplasmid,p3227,wasconstructed.The major difference between this and current plasmids is the separation of the inducible transgene and selectable marker promotersbytheplasmidbackbone.Theplasmidp3227wasabletosupportinducibleexpressionincelllinescontaining pSPR2.1aswellastheestablishedLister42729-13cellline.p3666,aderivativeofp3227,wasmadeforinducibleexpression of stem loop RNAi constructs and was effective for knockdown of DRBD3,which hadproved problematic using existing RNAiplasmidswithhead-to-headpromoters.Theplasmidsystemwasalsoabletosupportinducibletransgeneexpression andDRBD3RNAiknockdowninbloodstreamformcellsexpressingtetracyclinerepressor fromanintegratedcopyofthe plasmidpHD1313. Citation: Sunter J, Wickstead B, Gull K, Carrington M (2012) A New Generation of T7 RNA Polymerase-Independent Inducible Expression Plasmids for Trypanosomabrucei.PLoSONE7(4):e35167.doi:10.1371/journal.pone.0035167 Editor:AshokAiyar,LouisianaStateUniversityHealthSciencesCenter,UnitedStatesofAmerica ReceivedDecember19,2011;AcceptedMarch13,2012;PublishedApril12,2012 Copyright: ? 2012 Sunter et al. This