第2节聚合酶链式反应PCR.pptVIP

* Primer 1(From pCMV-Myc827-847): 5’TTC C A AGC TTC ACC ATG GCA TCA ATG CAG AAG C 保护性碱基 HindIII Myc tag Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝ 4×12＋2×11＝700C. Primer 2(From T10 1249-1270): 5’TCG C GG ATC CAG TGG CAT CAG AGA CTT GCT AAT C 保护性碱基 BamH I Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×11＋2×13＝700C. * PCR Mixture: Template DNA: 1 ?l (10ng) Primer 1: 1 ?l (10?M) Primer 2: 1 ?l (10?M) dNTPs: 4 ?l (2.5mM) Taq DNA polymerase: 0.5 ?l(5U/?l) 10×buffer（Mg+）: 5 ?l ddH2O: 37.5?l 50 ? l * PCR条件： 94℃变性5min后开始以下循环 94℃变性反应45 sec； 65℃退火反应45 sec； 72℃延伸反应1 min； 进行30个循环； 最后72℃反应7min； 4 ℃冷却恒定。 * 五、PCR产物分析 取3-5?l PCR产物，采用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。 * PCR结果： 0.8kb DNA Marker PCR product 3.0kb * 六、PCR污染与对策 （一）、污染原因 　　1、标本间交叉污染: 收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染; 标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染; 有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染. 　　2、PCR试剂的污染: 主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染. * 3、PCR扩增产物污染 （1）、PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性. （2）、气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题. 　4、实验室中克隆质粒的污染 因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简 便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大. * （二）、防止污染的方法 　　1、合理分隔实验室:最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区. 实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA. 　　2、吸样枪:由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染. 　　3、预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一 冰箱. 　　 * 4、防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用. 　 5、设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照 及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照. 　　6、减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止. 　　7、选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前 应先离心，将管