2013核酸的提取及相关.pptVIP

核酸的提取及相关技术 质粒DNA的提取、分离和纯化 基因组DNA的提取 总RNA的提取、分离和纯化 mRNA的分离和纯化 核酸电泳技术 限制性内切酶 I. 质粒DNA的提取、分离和纯化 一、质粒的基本性质 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子（covalently closed circular DNA, 简称cccDNA） ，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主的复制和转录系统，但质粒的复制和转录需要宿主细胞编码的某些酶和蛋白质。此外，质粒还具有编码某些酶的基因，如对抗生素的抗性等。 质粒的不相容性（incompatibility） 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时进入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞过程中相互竞争，只有一种质粒占优势。这样，过几代后，占小数的质粒将丢失，在细胞后代中只有二种质粒中的一种。这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。但利用不同复制系统的不同质粒可在同一宿主细胞中共同存在。 三、试剂 LB液体培养基: 蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（yeast extract）5g, NaCl 10g, 用NaOH调至pH7.2-7.5。高压下蒸汽灭菌20分钟。 LB固体培养基：每升液体培养基加12g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。 氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 ℃下保存备用。 溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 oC冰箱。 溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS. 溶液III: 5 mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml. RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/L NaCl, 终浓度为10mg/ml。100 ℃加热15分钟，冷却后分装。 饱和酚：市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。 氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。 酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。 TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 ℃冰箱。 四、操 作 步 骤 1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5?菌株接种在LB固体培养基（含50?g/ml Amp）中，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含 50?g/ml Amp）中，37℃培养约12小时至对数生长后期。 2．?? 质粒DNA的少量快速提取---碱裂解法 1).?取1.5ml培养液倒入1.5ml ependorf 管中，4℃下12000g离心30秒。 2).??弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。 3).??菌体沉淀重悬浮于100?l 溶液I中（激烈震荡，充分混匀），室 温下放置5-10分钟。 4).??加入新配制的溶液II 200?l， 盖紧管口，并倒置离心管，温和颠 倒ependorf管数次，以混匀内容物（千万不要震荡）中，冰浴中 放置5分钟。 5).?加入150?l预冷的溶液III， 盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒 ependorf管数次，以混匀内容物，冰浴中放置5-10分钟。4℃下 12000g离心5-10分钟, 取上清。 附: 日常型质粒DNA小量纯化试剂盒（硅膜吸附） 原理： 带负电荷的DNA和带正电的二氧化硅粒子有很高的亲和力。阳离子Na发挥桥梁作用，吸附核酸磷酸盐骨架上带负电荷的氧，在高盐的酸性条件下，Na+ 打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，DNA与二氧化硅紧密结合，先洗涤除去其他杂质，再用低离子强度的TE缓冲液或蒸馏水洗脱结合的DNA分子。 操作步骤 第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseAl全部加入到S1溶液中，混合均匀，4℃保存。 1．取3ml在LB培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少)，12000rpm离心20s，弃尽上清； 2．用0.25ml已加入RNa