血红蛋白的提取和分离经典.pptVIP

血红蛋白  1、凝胶色谱法 凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称分子筛层析 。 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，例如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等 最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。 二、实验步骤 初次离心后的结果 （3）分离血红蛋白溶液： 凝胶色谱柱的制作 4、纯度鉴定（电泳）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。 1、垂直板电泳装置 2、稳流稳压电泳仪； 3、微量进样器（可用微量移液器代替） （1）、 胶板的制备： ①.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 ②.把玻璃板在灌胶支架上固定好 （2）、分离胶的制备： 按下表制备分离胶(T=12%,pH=8.8) 试剂 双蒸水 分离胶缓冲液　 丙胶贮液 Ap 　TEMED 用量 1.65mL 　1.3mL 　　　2.0mL 　 0.05mL 0.002mL 胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。 （3）、 浓缩胶的制备： 按下表制备浓缩胶(T=4%,pH=6.8) 　试剂 双蒸水 　浓缩胶缓冲液 丙胶贮液 Ap 　TEMED　　　　　　用量 1.46mL 0.25mL 　0.27mL 　 0.02mL 0.002mL 用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→聚合。 （4）、取样 　 　取纯化后的血红蛋白样品10μ L加入10μ L上样buffer（内含少许溴酚蓝的40％蔗糖 ）混匀。 （5）装槽、点样： 拔出梳子→ 将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内） →在电泳槽中加入缓冲液→ 点样。 （6）电泳： （7)、剥胶、染色及脱色 凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。 (8)、结果 3.样品的加入和洗脱 1.调液面 2.加样 3.再调液面 4.洗脱 5.收集 缓冲液 凝胶 ①调整缓冲液面：与凝胶面平齐 ②滴加透析样品：加到色谱柱的（ ） ③样品渗入凝胶床：（ ） ④再调整缓冲液面洗脱： ⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时收集 顶端 样品完全进凝胶层 红色的蛋白质 色谱柱制作成功的标志： 红色区带均匀一致的移动 记 （1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 等因素。 它所带静电荷的多少以及分子的大小 （2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（ ）。 分子的大小 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图（A为正面，B为剖面）1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.73：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3 10 ①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 ②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。 【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是 A.它们都是分离蛋白质的重要方法 B.它们的原理相同 C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要 D.以上说法都正确 【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点： (1)凝胶色谱法的原理； (2)电泳法的原理。 A 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定（电泳） 实验操作 样品处理 （一）蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程 红细胞的洗涤 粗分离： 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液 纯化： 纯度鉴定 透析—去除样品中分子量较小的杂质 用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质 SDS-聚丙烯酰