棉花T-DNA标签雄性不育突变体鉴定及相关基因克隆及的分析.docx

山东师范大学硕士学位论文 棉花Ｔ＿ＤＮＡ标签雄性不育突变体的鉴定 与相关基因的克隆及分析 中文摘要 目前，拟南芥、水稻、玉米等植物的基因组测序已经完成，将这庞大的遗传 信息与基因功能联系起来为主要目标的功能基因组学已成为生物科学研究的重 点。在植物的基因克隆和功能分析研究中有许多种策略，利用突变体就是其中之 一。但是自然条件下突变体发生的频率非常低，且不容易被发现，所以主要用各 种物理、，化学和生物技术的方法来人工诱导产生突变体。农杆菌介导的Ｔ－ＤＮＡ 标签法是目前是研究植物功能基因组最有效、使用最广泛的手段。国际上通过拟 南芥重要性状突变体研究双子叶植物的生理、发育问题，取得了显著的成就，解 决了许多以前无法解决的一些重大科学难题。拟南芥中通过Ｔ－ＤＮＡ法克隆的基 因占到其所有克隆基因的４０％。对这些基因功能的研究和利用将为提高作物的产 量、品质、抗逆提供更有效的途径。 棉花是世界上重要的经济作物，提高皮棉产量和改良纤维品质具有重要的经 济效益。目前，利用不同品种间的杂交优势，即杂种优势利用，是提高产量和改 良纤维品质的主要手段之一。但是目前生产上大面积推广的杂交组合，仍然以人 工去雄授粉为主，制种成本过高已经成为棉花杂种优势利用的主要限制因素。棉 花已经鉴定了一些不同类型的雄性不育系，但一直难以在杂交制种中应用。因此 利用基因工程手段克隆育性相关的基因，并加以利用创造理想的棉花雄性不育系 类型，可能成为促进杂种优势利用，提高棉花产量和品质的新途径。 本文研究利用根癌农杆菌介导的Ｔ－ＤＮＡ插入得到的具有突变表型的ＴＯ代转 基因棉花突变体，与野生型Ｃｏｋｅｒ３ １２杂交后得到了产生育性分离Ｆ１代，Ｓｏｕｔｈｅｍ 杂交分析和ＰＣＲ分析证明雄性不育突变表型是由单位点单拷贝的Ｔ＿ＤＮＡ插入引 起的显性突变。为了研究该Ｔ－ＤＮＡ插入点的基因组序列的功能和对棉花生殖发 育的影响机制，对雄配子体减数分裂的过程进行了研究并对花药做石蜡切片分析 突变产生的时期和位置。发现花粉母细胞到四分体小孢子时期突变体发育正常， 但小孢子从胼胝质释放出来后，突变体的许多四分体并不分开。利用ＴＡＩＬ．ＰＣＲ、  山东师范大学硕士学位论文  ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ、筛选基因组文库等方法克隆插入位点的基因组序列，共得到了  ２２４０ｂｐ的基因组序列。对比Ｔ－ＤＮＡ插入前后的序列变化和对插入位点基因组序 列进行生物信息学分析，发现Ｔ－ＤＮＡ的插入导致了１１ ５ｂｐ的缺失和ｒｉ曲ｔ  ｂｏｒｄｅｒ  一侧的部分序列的重排。对克隆的２２４０ｂｐ的Ｔ＿ＤＮＡ插入位点的棉花基因组原始 序列进行ＢＬＡＳＴ分析，结果显示一段与拟南芥一ｓｎｏＲＮＡ基因同源性为７１％的 １２５ｂｐ的核苷酸序列，位于Ｔ－ＤＮＡ插入的右边界一侧；一段与陆地棉ｍＲＮＡ同 源性为９４％的４４４ｂｐ的序列，位于Ｔ．ＤＮＡ插入的左边界一侧；该序列的功能还 有待下一步的验证。 关键词：棉花、根癌农杆菌、Ｔ－ＤＮＡ、突变体、雄性不育、ＰＣＲ、序列分析 分类号：Ｑ７８ ２  山东师范大学硕士学位论文  Ｔ＿ＤＮＡ Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｍａｌｅ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｍｕｔａｎｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃ１０ｎｉｎｇ ｉｎ  Ｕ．ｐｌａｎｄ  Ｃｏｔｔｏｎ（Ｇａ蛳ｆ甜ｍ＾ｆ，苫“ｆ“，，ｚ Ｌ．）  ＡＢＳＴＲＡＣＴ  Ａｔ  ｐｒｅｓｅｎｔ，心ａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｒｉｃｅ，ｃｏｍ ｐｌａｌｌｔ  ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａＳ ｂｅｅＩｌ ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ，ｔｈｊｓ  ｈｕｇｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉ１１】ｂｍａｔｉｏｎ  ｌｉＩｌｌ（ｅｄ ｔｏ ｇｅｎｅ ｎｍｃｔｉｏｎ ｈａＳ ｂｅｃｏｍｅ ｔｌｌｅ ｆｏｃｕｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｙ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅｒｅ  ａｒｅ  ｍａｎｙ ｌ【ｉｎｄｓ ｏｆ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｃｌｏｌｌｉｎｇ ａｎｄ  ｆｈｎｃｔｉｏｎａｌ觚ａｌｙＳｉｓ，  ｏｎｅ  ｏｆ ｗｒｈｉｃｈ ｉｓ ｕｓｉｎｇ ｋｉｎｄｓ ｏｆ Ｉｎｕｔａｌｌｔ．Ｓｉｎｃｅ ｍａｔ ｓｐｏｎｔａｌｌｅｏｕｓ  ｍｕｔａＩｌｔ ｉｓ ｉｎ Ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｆ．ｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｄｉｍｃｕｌｔ  ｔｏ ｆｉｎｄ ｏｕｔ，ｉｔ  ｂｅｃｏｍｅｓ ｔｈｅ ｍａｊｎ ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ ｐｈｙｓｉｃａｌ，ｃｈｅｍｉｃａｌ ａＩｌｄ  ｂｉｏｌｏ百ｃａｌ  ｔｅｃｌｌｒｌｏｌｏｇｙ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｎｍｌｃｅ ｍｍａｎｔ ａｎｄ 伽６口ｃ纪一“聊一ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔ—ＤＮＡ ｔａｇｇｉｎｇ