血管紧张素Ⅰ放射免疫探析方法(固相抗体法)建立.docVIP

血管紧张素Ⅰ放射免疫分析方法(固相抗体法)的建立 　　【摘 要】目的：采用固相抗体包被方法，建立血管紧张素Ⅰ放射免疫分析方法。方法：通过对抗体包被步骤、抗体稀释浓度、反应时间、反应体积等条件进行选择，建立新的分析方法，并进行方法学鉴定。结果：本项工作所建立的分析方法测量范围为100-7800pg/ml，灵敏度为42.2 pg/ml。批内、批间变异均小于10%，回收率为90.3%―102.2%。结论：本项工作所建立的固相抗体方法与原有分离试剂分析方法相比，具有操作步骤少、反应时间短等优点，更加方便临床检测 【关键词】血管紧张素Ⅰ 固相抗体法 放射免疫分析 1引言 采用固相抗体包被聚苯乙烯试管，并对抗体包被条件进行了研究，建立了血管紧张素Ⅰ放射免疫分析法。结果表明在2―8℃下过夜包被，抗体滴度在1：9万 时，制备的包被管用于血管紧张素Ⅰ放射免疫分析，结合达到最大；不同滴度下包被，包被温度和时间对制备的包被管的影响不同；不同的反应时间以及125I―AI和标准品加样量的不同也会对包被管的结合产生影响。血管紧张素Ⅰ包被管法放射免疫分析灵敏度为（42.2Pg/ml）；回收率为（90.3%―102.2%）；批内、批间变异系数分别为（5.1%―9.0%）和（8.3%―10.2%） 2实验材料 血管紧张素Ⅰ多克隆抗体由原子高科医学二部提供；聚苯乙烯六角试管（mm×mm）为（哪个）塑料厂产品；125I―AI及AI药盒标准品由原子高科医学二部提供；蛋白G填料亲合层析柱由美国进口；牛血清白蛋白（BSA）为上海生物制品厂产品。对照药盒由原子高科股份有限公司生产（国药准字：）。其他试剂均为分析纯 3实验方法 3.1兔IgG的纯化 采用蛋白―G柱进行亲合层析纯化，纯化后IgG浓度由紫外分光光度法测定 用包被缓冲液（0.1M PH9.5碳酸缓冲液）将兔IgG配制10μg /ml。混合均匀后250？L /管包被，然后放2―8℃过夜，弃去包被管中第一层包被液，各管用500？L洗涤液（0.02 mol/L，pH7.4磷酸缓冲液）清洗1次。待包被第二层（兔二抗）用 3.2用驴抗兔二抗进行第二层包被 用0.05 mol/L，pH7.4磷酸缓冲液（含1%BSA）将兔二抗配成合适的浓度后250？L /管包被，然后放2―8℃过夜，弃去包被管中第二层包被液，各管用500？L洗涤液（0.02 mol/L，pH7.4磷酸缓冲液）清洗1次。待包被第三层（兔一抗）用 3.3不同滴度兔抗（一抗）包被实验 将兔抗用封闭液配制成1：2万，1：4万，1：6万，1：8万，1：9万，1：12万，1：14万，1：16万不同的滴度，分别加250？L于已经包有兔二抗的包被管中，每个滴度做双复管，之后在每管中加入100？L 125I―AI，然后放2―8℃静置过夜；弃去管中溶液，各管用500？L洗涤液清洗3次后测量各管放射性计数，计算其结合率，选择合适的抗体滴度作为工作稀释度 3.4温度，时间对抗体包被的影响 用封闭液将兔抗（一抗）稀释成不同滴度（1：2万，1：4万， 1：8万，1：9万，1：12万，1：14万），分别在不同温度和时间下包被，实验中抗体加入体积均为250？L，各管均加入100？L 125I―AI，将不同条件下制备的包被管进行放射免疫结合分析，并对结果进行比较 3.5抗体包被管的制备 每管加250？L兔IgG溶液（10μg /ml），2―8℃静置过夜，弃溶液，各管加500？L洗涤液清洗1次后加入250？L驴抗兔二抗溶液，2―8℃静置过夜，弃溶液，各管加500？L洗涤液清洗1次后加入250？L兔一抗溶液（1：9万），2―8℃过夜，弃溶液，各管加500？L洗涤液清洗1次，弃溶液，自然晾干，密闭，于2―8℃下保存 3.6体系反应时间，温度的选择 设计不同的反应条件为37℃1h，37℃3h，4℃15h，4℃24h 3.7加样量的选择 设计4组不同的加样量为：第一组125I―AI加100？L，标准品加100？L；第二组：125I―AI加100？L，标准品加50？L；第三组125I―AI加50？L，标准品加100？L；第四组125I―AI加50？L，标准品加50？L 3.8放射免疫分析程序 标准品（或样品、质控血清）100？L和标记物100？L加于包被管中，混匀，然后放2―8℃静置过夜（15―24h），弃溶液，加500？L洗涤液清洗2―3次，测各管放射性计数 3.9方法学考核 灵敏度：以20个零标准管的计数平均值―2S对应的剂量值表示。准确度：任取一份血浆标本，测定基值后分别加入0pg/ml ，250pg/ml，625 pg/ml，1560 pg/ml的标准品，再次测定，计算回收