第11章金免疫技术免疫学.ppt

第11章 胶体金免疫技术 掌握胶体金免疫技术原理、技术要点 熟悉金免疫检测的临床应用 了解胶体金和免疫金的制备 胶体金免疫技术（colloidal gold immunoassay ）是一种以胶体金作为标记物，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。 第一节 胶体金与免疫金的制备 1. 胶体金的制备 2. 免疫金的制备 3. 免疫金的保存 1.1胶体金的结构 胶体金是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。 1.2 胶体金特性 1.2.1一般性质： 颗粒大小多在1～100nm（gold nanoparticles） 胶体金溶液：稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中。 具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。 1.2.2 呈色和光吸收性 粒子大小不同，光吸收性不同，颜色亦不同： 10～20nm，吸收峰530nm，呈橙色。 20～80nm，吸收峰600nm，呈紫红色。 根据这一特点，可用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。 1.2.3 稳定性 稳定:颗粒做布朗运动不易受重力影响而下沉. 又不稳定:自身因素与外部因素. 2.胶体金的制备 2.1 制备原理 向一定浓度的氯金酸溶液内加入一定量的还原剂，使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。 常用的还原剂：白磷、硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸钠、鞣酸等。 2.3 鉴定和保存 指标：粒径大小，均一度，有无凝集 粗略：日光；分光光度计 电镜：统计胶体金的平均粒径。 良好的胶体金应该是清亮透明的。 若混浊或表面有漂浮物，提示有较多的凝集颗粒。 胶 体 金（15~60 nm） 室温、避光、无尘、洁净器皿：3个月。 加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。 4℃,半年。 -20℃× 尽快标记 三、免疫金的制备 概念：免疫金（immunogold） 是指胶体金与Ag或Ab的结合物, 有时称之为金探针。 目前多认为： 当溶液的pH值等于或略高于蛋白质的PI时，蛋白质分子的表面张力最大，易于吸附在金颗粒的表面。 技术要点 (1) 胶体金溶液的pH值调整：调节至PI或偏碱。 (2) 蛋白质最适标记量的确定：系列稀释蛋白，加一定量胶体金，NaCl, 以红色保持不变而蛋白含量最低的一管为最适标记量。 (3) 标记过程；搅拌、加一定量稳定剂（BSA/PEG）。 (4) 标记物纯化:离心法、过柱。 免疫金的保存 用含稳定剂的buffer，其中PEG、BSA为最常用稳定剂。 第二节 胶体免疫测定技术 一、斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay) 二、斑点金免疫层析试验(dot immunogold chromatographic assay) 一、斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno-gold filtration assay） 双抗体夹心法为例： 将Ab点加在固相载体NC膜上(渗滤装置）。 当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含Ag被膜上Ab捕获。 其后加入的免疫金与已结合在膜上的Ag相结合。 因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点 （二）方法类型 1．双抗体夹心法 2．间接法 DIGFA—双抗体夹心法测抗原 间接法测抗体 二、 斑点金免疫层析试验 （dot immunogold chromatographic assay) 原理： 滴加在膜一端的标本受膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，被分析物与固定于载体膜上某一区域的Ab或Ag结合，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判定实验结果。 DIGFA 穿流（flow through） DICA 横流（lateral flow） (二) 方法类型 1.双抗体夹心法 2.竞争法/抑制法 3.间接法 1.双抗体夹心法 结果观察 2.竞争法 结果观察 3.间接法 待测血清标本中含有大量的非特异性IgG， 间接法(反流免疫层析) 第三节 胶体金免疫组化技术 一、免疫金电镜染色技术 二、免疫金（银）光镜染色技术 一、免疫金电镜染色技术 （一）原理 通过免疫反应，沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用还原剂将银离子(Ag+)还原成银原子(Ag)，被还原的Ag围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大“，最终使抗原位置得到清楚放大。 2.评价 小结 1 金免疫测定技术 斑点金免疫渗滤试验：原理、技术类型、技术要点 斑点金免疫层析试验：原理、技术类型、技术要点 2金免疫组织化学技术 免疫金(银)光镜染色技术 免