菊花RNAi载体构建与青蒿遗传再生体系的建立.pdfVIP

CONSTRUCTION OF RNAi EXPRESSION VECTOR OF DENDRANTHEMA × MORIFOLIUM MET 1 GENE AND ESTABLISHMENT OF REGENERATION SYSTEM OF ARTEMISIA ANNUA L. A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science By Ma Huanxin Supervisor: Prof. Wang Zicheng May,2015 摘 要 菊花 （Dendranthema ×morifolium ）是多年生宿根草本植物，因其品种、花色和花 型众多，具有很高的观赏价值，而备受大众喜爱和研究者的青睐。青蒿（Artemisia annua L. ）是一年生草本植物，常作为菊花嫁接的优良砧木。DNA 甲基化是表观遗传学的一种 重要的修饰方式，在植物中普遍存在且发挥着重要的作用。RNAi(RNAi interference)是 关闭特定基因的新技术，在植物功能基因组、植物育种、植物抗逆方面得到广泛应用。 本研究以DNA 甲基化修饰能影响植物的形态特征以及RNAi信号能够通过砧木传递作为 研究基础。构建能够影响菊花但不影响青蒿MET 1 基因的RNAi载体，同时建立青蒿的遗 传再生体系，为后续的遗传转化奠定了基础。研究主要结果如下： （1）靶基因序列克隆 以菊花紫精灵为实验材料，克隆得到含有不同酶切位点、大小为273 bp 的片段，经 测序分析，同源性为97% 。确定该序列即为紫精灵MET 1 基因的一部分。 （2 ）菊花RNAi载体的构建 将靶基因片段通过酶切-连接法，正反向插入载体DHpart27RNAiFADP 1P4 上，经特 异性引物PCR扩增验证、酶切和测序，证实菊花MET 1 基因序列在载体构建中未发生突 变，RNAi载体构建成功。通过冻融法成功将RNAi载体转入农杆菌GV3101 中。 （3 ）本研究取自种青蒿生长40 天的幼嫩的叶片、叶柄为外植体，建立了叶片和叶 柄的遗传再生体系。 ① 叶片和叶柄最佳的消毒效果分别是：0.1% 的升汞中浸泡8 mim和0.1% 的升汞中 浸泡10 mim 。叶片和叶柄存活率分别达到92.1%和84.5%。 ② 最佳愈伤诱导培养基 实验结果表明，叶片和叶柄均在培养基配方为：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D +3%蔗糖+0.7%琼脂粉的固体培养基上愈伤诱导最好，并且叶柄诱导率达到95.7%,远高 于叶片的诱导率（78% ）。 ③ 最佳分化培养基 叶片在培养基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA +3%蔗糖+0.7%琼脂粉的固体培 养基上分化率最高达到95.3% 。叶柄在培养基MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D +3%蔗 I 糖+0.7%琼脂粉的固体培养基上能一次成苗，成苗率为11%。 ④ 最优生根培养基 将分化出的青蒿幼苗在 1/2MS+1.0 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉的培养基上生 根，在转接后的第6 天，有白色的根眼萌发，根生长快并且粗壮，生根率达到98.9% 。 21 天后将生好根的青蒿，移栽到室外，成活率为90% 。 关键词：菊