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第三章3谷氨酸发酵机制 味精的各种制法 植物蛋白水解法：以面筋或豆粕等植物蛋白为原料，经酸解后分离出谷氨酸，再制成味精。成本高、产率低、劳动条件恶劣、副产物多。 化学合成法：以丙烯腈为原料合成。需高温、高压及多步反应，谷氨酸需DL型分离。 发酵法：原料易得、常温常压、设备通用。需要合适的微生物。 谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生物合成 1 谷氨酸脱氢酶催化的还原氨基化 ?-酮戊二酸+NH4++NADPH2→谷氨酸+NADP 2 转氨酶催化的转氨反应 ?-酮戊二酸+氨基酸→谷氨酸+ ?-酮酸 3 谷氨酸合成酶催化的反应 ?-酮戊二酸+谷氨酰胺→2谷氨酸 其中谷氨酸脱氢酶催化的还原氨基化是主导反应 谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生物合成途径 谷氨酸棒杆菌合成谷氨酸调节机制 谷氨酸棒杆菌谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量时，就会反馈抑制谷氨酸脱氢酶，使草酰乙酸转向合成天冬氨酸。天冬氨酸过量后，反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，停止草酰乙酸的合成。正常情况下，谷氨酸无法积累。除非生成的谷氨酸不断排出细胞外。 谷氨酸理论转化率 1 如果四碳二羧酸全部由乙酰辅酶A通过乙醛酸循环供给.则有: 3C6H12O6→6丙酮酸→6乙酸+6CO2 6乙酸+2NH3+3O2→2C5H9O4N+2CO2+6H2O 理论转化率=2×147/(3×180) ×100%=54.4% 谷氨酸理论转化率 如果四碳二羧酸全部由CO2固定获得,则1摩尔葡萄糖生成1摩尔的谷氨酸. C6H12O6+NH3+1.5O2→C5H9O4+CO2+3H2O 理论转化率=147/180=81.7% 谷氨酸产生菌的主要特征 1 ?-酮戊二酸氧化能力微弱: ?-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低. 2 谷氨酸脱氢酶活性强. 3 还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱. 4 异柠檬酸裂解酶活力微弱. 5 不利用谷氨酸. 谷氨酸产生菌的主要特征 6 耐高糖耐高谷氨酸 . 7 CO2固定能力强. 8 解除谷氨酸反馈抑制. 9 具有向胞外分泌谷氨酸的能力. 谷氨酸生产菌细胞膜的通透性 用能积累谷氨酸菌株做如下实验: 生物素充足时,细胞内含大量谷氨酸,但培养液里几乎不含谷氨酸. 用溶菌酶消化细胞壁得到的原生质体仍不分泌谷氨酸. 当把原生质体放入低渗溶液里,将其涨破,谷氨酸才排出. 生物素亚适量时,培养液里含大量谷氨酸,细胞里含量少. 结论:谷氨酸的分泌是由细胞膜控制 细胞膜结构 甘油三酯分子结构 磷脂分子结构 控制细胞膜通透性的方法 控制磷脂的合成 控制细胞壁的合成 选育温敏突变株 生物素营养缺陷型 作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Gly向膜外泄漏. 控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10?g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换. 油酸营养缺陷型 作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右. 控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换. 添加表面活性剂 添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸. 机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜. 关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞. 添加青霉素 机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸. 控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换. 谷氨酸发酵常见问题 谷氨酸“强制控制” 发酵 谷氨酸的“发酵转换” 谷氨酸菌种纯化要点 尿素中毒 谷氨酸减少 谷氨酸发酵的OD值很重要 谷氨酸发酵强制控制工艺 为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取“强制控制”的方法,如:“高生物素 高土温”或“高生物素 高青霉素”的方法. 控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量变化的影响,高生物素 大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产. 发酵工艺控制实例 某厂使用天津轻工学院选育的WTH-1菌株,以甜菜糖蜜为原料,采用“高生物素 高土温”工