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　　TTV核酸模板快速制备方法论文 .freelitted virus nucleic acid template SU Ming-Quan 1 ，FENG Ji-Hong 2 ，YU A Yue-Yun 1 ，ZHANG Jian-Fang 1 ，ZHANG Lin 1 ，LIU Jia-Yun 1 1 Center of Clinical Molecular Biology，Xijing Hospi-tal，Fourth Military Medical University，Xian710033，China，2 Deparment of Infectious Diseases，College of Medicine，Yanan University，Yanan716000 Keyitted virus;polymerase chain reaction;DNA preparation Abstract:AIM To establish a method adapting to rapid preparation of TTV DNA from bulk samples for PCR.METHODS TTV nucleic acid template ethods，viz.hydroxybenzene chloro-form extraction and directly rapid cracking.RESULTS DNA abstracted by the tethods plified at same PCR parameter and the coincidence rate ain laboratory diagnosis method is to detect its DNA by PCR，so it is very important to establish a method for rapid preparation of TTV DNA from bulk samples. 0 引言 TT病毒是近年新发现的一种肝炎病毒，当发现一种新的病原性相关病毒因子时，建立一种敏感、快速、特异的实验室检测方法并评价该病毒因子在肝病中的价值是十分重要的，该方法的临床适用性和可行性，是评价所建立方法在临床上应用价值的关键所在.目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据，建立具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法，对TTV肝炎的快速诊断，具有重要的意义.我们从临床快速检测需要为目的，寻求建立一种快速、简便的TTV核酸制备方法，用于大批量临床标本的检测，获得满意的结果. 1 材料和方法 1.1 材料 非甲～非庚型肝炎血清30例，来自延安大学医学院传染科;慢性乙型肝炎患者血清50例，来自西京医院就诊患者;引物及合成:根据Nishizamol L-1 Tris-HCl pH8.0，200mmol L -1 NaCl，10mmol L-1 EDTA，20g L-1 SDS，1g L-1 蛋白酶K），60℃水浴60min，加等体积酚:氯仿:异戊醇（25∶24∶1）混匀，4℃冰浴下30min，2000g离心10min，取上清加等体积预冷无水乙醇-20℃过夜，1000g离心20min，沉淀溶于20μL0.1×TE缓冲液中，备用.②直接快速制备法:20μL血清加50μL快速裂解液（50mmol L-1 Tris HCl，pH8.0，50mmol L1 KCl，1.5mmol L-1 MgCl，10g L -1 NP-40，5g L-1 Tin，1000g离心10min，取上清做模板.③PCR扩增:第1轮PCR扩增:总反应体积为25μL，包括:10×PCR缓冲液2.5μL;4×dNTP2.0μL;外引物各1.0μL（50pmol L -1 ）;DNA模板5.0μL;Taq DNA酶3U μL-1 ;无菌蒸馏水12.5μL;无菌石蜡油30μL覆盖液面，94℃变性3min，进入PCR循环，循环条件:94℃50s，55℃50s，72℃70s，32个循环，最后72℃延伸5min.第2轮PCR扩增:总反应体积为25μL，包括:10×PCR缓冲液2.5μL;4×dNTP2.0μL;内引物各1.0μL（50pmol L-1 ）;第1次PCR产物5.0μL;Taq DNA酶1.5U μL -1 ;无菌蒸馏水12.5μL;无菌石蜡油30μL覆盖液面，94℃变性3min，进入PCR循环，循环条件:94℃50s，55℃50s，72℃70s，32个循环，最后72℃延伸5min.④产物检测:取15μL第2次PCR扩增产物，于20g L-1 琼脂糖（含EB）凝胶中，电泳100V30min，紫外