亲水液相色谱三重四极杆质谱联用法快速检测尿液和血浆中河豚毒素论文.docVIP

　　亲水液相色谱三重四极杆质谱联用法快速检测尿液和血浆中河豚毒素论文 【摘要】 建立了快速检测尿液和血浆中河豚毒素的亲水液相色谱三重四极杆质谱联用分析方法。样品经乙腈沉淀、TSKgel Amide80亲水色谱柱分离后，采用电喷雾串联质谱多反应监测(MRM)模式检测，基体匹配标准外标法定量。尿液和血浆样品的线性范围分别为3～500 μg/L和1～200 μg/L，加标回收率分别为96%～108%和100%～105%，相对标准偏差小于9%和16%(n=6)，样品的检出限分别为1.0和0.3 μg/L(S/N=3)。本方法简单、快速、灵敏、特异性强。 【关键词】 亲水液相色谱三重四极杆质谱法， 河豚毒素， 尿液.freelg 就会引起中毒，2 mg 即可导致死亡，所以发生中毒时尿液和血浆中TTX的浓度很低，在μg/L数量级上，常规方法无法检出。有报道采用液相色谱柱后衍生荧光检测法10和液相色谱离子阱质谱联用法选择离子监测模式11测定中毒病人尿和血中TTX含量，方法的检出限为5 μg/L； Kain，TTX在死时间附近出峰。 本研究采用1%醋酸的乙腈沉淀蛋白，液相色谱三重四极杆质谱法测定尿液和血浆中TTX。一次进样分析仅需1 3min，方法快速、简单、灵敏、选择性好，适合于TTX中毒的确证分析。 图１ 河豚毒素及其类似物的化学结构（略） Ｆig.1 Chemical structures of naturally occurring tetrodotoxins(TTXs) 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 Aquity UPLCQuattro Premier XE超高效液相色谱串联质谱仪配有电喷雾源(美国asslynx 4.1工作站；MS2旋涡混旋器(德国IKA公司)；HUP100手持式超声波细胞破碎仪(天津恒奥科技发展有限公司)；TGL16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂）；Gradient A10 MillQ 超纯水器(法国Millipore公司）。 乙腈和甲醇(HPLC级，德国Merck公司); 甲酸铵 (HPLC级，Fluka公司); 96%甲酸和冰醋酸(HPLC级，美国Tedia公司)；河豚毒素标准物质(纯度≥99%，大连瑞芳生化物品有限公司)，用乙腈水配制成100 mg/L标准贮备溶液，保存于－35 ℃冰箱中。 2.2 样品前处理方法 吸取300 μL尿液于盛有700 μL 1%醋酸乙腈溶液的1.5 mL Safelock尖底离心管中，旋涡30 s，以12000 r/min离心5min，取上清液待测。 同时在6支试管中分别按标准曲线的浓度加入适量标准溶液，加入空白尿液至1000 μL，混匀，吸取300 μL与样品一起处理，制作工作曲线系列。 吸取500 μL血浆于10 mL试管中，加入1.5 mL 1%醋酸乙腈溶液， 用手持式超声波细胞破碎仪均质2 min, 以4000 r/min离心4 min, 吸取1.0 mL上清液于10 mL试管中, 50 ℃水浴氮气吹干，加入250 μL流动相, 超声1 min, 旋涡30 s, 上清液待测。 同时在6支试管中分别按标准曲线的浓度加入适量标准溶液，加入空白血浆至500 μL，混匀，放置30 min后，加入1.5 mL 1%醋酸乙腈溶液，与样品一起处理，制作工作曲线系列。 2.3 色谱质谱条件 TSKgel Amide80色谱柱（150 mm×2.0 mm， 3 μm， Tosoh Bioscience公司）； 流动相A为含0.015%甲酸和2 mmol/L甲酸铵的50%甲醇水液(V/V)； 流动相B为含0￥015%甲酸和2 mmol/L甲酸铵的乙腈水液（95∶5,.freelin, 52% A; 9～11 min, 100% A; 11～13 min, 52% A。流速：0.2 mL/min；柱温：40 ℃; 进样体积：10 μL。 电喷雾离子源，通过正离子多反应监控扫描(MRM)模式。ESI+毛细管电压： 3.2 kV；离子源温度：120 ℃；锥孔反吹气流量：50 L/h，脱溶剂温度：350 ℃，脱溶剂气流量：500 L/h，碰撞室氩气压力：0.346 Pa。其它质谱参数见表1。 运行开始时，色谱柱流出液经六通切换阀切换至废液中， 直到5.20 min, 质谱从5.20 min开始采集数据， 直到9.10 min结束, 同时六通切换阀又将柱流出液切换至废液中。 表1 质谱的MRM参数（略） Table 1 MS parameters for multiple reaction monitoring * 定量离子对(Quantificational ion pair)。