CD59结合短肽对补体介导的前列腺癌细胞溶解影响论文.docVIP

　　CD59结合短肽对补体介导的前列腺癌细胞溶解影响论文 【摘要】 目的 观察CD59结合短肽(sp22)对补体介导高表达人CD59分子的PC3细胞溶解的影响。方法利用脂质体法将携带人野生型CD59基因的pIRES质粒(olecules on lysis of plementmediated prostate cancer PC3 cells an munohistochemistry technique. The effect of sp22 or antiCD59 monoclonal antibody on plementmediated cytotoxicity to transfected PC3 cells ent lysis assays. Results PC3 cells highly expressing CD59 molecules e concentration of sp22 and antiCD59 monoclonal antibody, the lysis rate of transfected PC3 cells in sp22 group onoclonal antibody group (q=7.805-12.280,P 0.05). Conclusionsp22 can effectively block the plementbinding sites of CD59 molecules highly expressed on PC3 cells, therefore, the antitumor effect of the plement stimulated by antiPC3cell antibody can be enhanced. KEY HPMC，委托北京Scilight Biotechnology有限责任公司合成;抗CD59单克隆抗体(H19克隆，BD Biosciences公司产品);FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(中杉金桥公司产品);兔抗PC3细胞多克隆抗体(本教研室按常规方法制备);pIRES 真核表达质粒(Takara公司产品);a公司产品);人前列腺癌PC3细胞(我院病理生理学教研室于晓玲教授惠赠)。 1.2 PC3细胞的转染和稳定转染细胞克隆的筛选 1.2.1 PC3细胞的培养 PC3细胞用含体积分数0.10胎牛血清、 105 U/L青霉素、105 U/L链霉素的RPMI 1640培养液(完全培养液)在 37 ℃、体积分数0.05 的CO2条件下培养，达到80%～90% 细胞融合度时，用2.5 g/L胰酶消化后传代培养。 1.2.2 PC3细胞的转染 用2.5 g/L胰酶消化生长状态良好的PC3细胞，用RPMI 1640完全培养液调整细胞密度为2×108/L，加入24孔细胞培养板，每孔0.5 mL，于37 ℃、体积分数0.05 的CO2条件下培养24 h。弃孔内培养液，用RPMI 1640培养液洗2次，然后各加0.4 mL RPMI 1640培养液。按Lipofectin Reagent试剂说明书中的方法分别将 g/L的G418、含体积分数0.10的胎牛血清及105 U/L青链霉素RPMI 1640培养液在 37 ℃、 体积分数0.05的 CO2条件下培养筛选转染细胞，隔天换液1次。当单个细胞克隆增殖至数十个细胞时，套取至24孔板中，将G418调整为400 mg/L，继续大量扩增培养。 1.3 转染细胞的荧光免疫染色 分别取ol/L PBS洗涤2次，涂片，吹干。用体积分数0.95的乙醇溶液固定5 min，待干。加入1∶1 280稀释的抗人CD59单克隆抗体10 μL(阴性对照加10 μL小鼠IgG2a)，置湿盒中37 ℃孵育45 min;用PBS洗涤3次，每次5 min;加入1∶640稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体10 μL，湿盒中37 ℃继续孵育45 min;用PBS洗涤3次，每次5 min，干后镜检。 1.4 补体溶解试验 将60%～80%融合度的g/L，每个浓度各设6个复孔。37 ℃孵育30 min后，每孔加入1∶500稀释的兔抗PC3细胞多克隆抗体和新鲜人血清(终浓度为80 mL/L)各25 μL，37 ℃孵育1 h。每孔各加10 μL浓度为5 g/L的MTT后，37 ℃孵育4 h，然后每孔加入100 g/L SDS0.02 mol/L盐酸混合溶液100 μL，轻轻吹打混匀后，再利用微量振荡器振荡溶解15 min，用酶标仪测定630 nm波长处吸光度值。对照组设6个复孔，不加sp22和抗CD59单克隆抗体(用50 μL RPMI 1640培养液代替);非溶解组