siRNA沉默HIF1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞VEGF表达的影响论文.docVIP

　　siRNA沉默HIF1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞VEGF表达的影响论文 吴欣爱，孙燕，樊青霞，王留兴，王瑞林，赵培荣，张岚 【摘要】 目的 观察体外乏氧培养条件下食管鳞癌细胞系EC9706中HIF1α和VEGF的表达，探讨HIF1α在低氧条件下对食管鳞癌血管生成的调控作用。方法 CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境.freelRNA和蛋白水平的表达。采用化学合成小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰技术（RNAi）用siRNA转染EC9706细胞。观察转染后HIF1α沉默效果。结果 低氧条件下，EC9706细胞HIF1α mRNA水平稳定，蛋白表达显著升高，而VEGF mRNA和蛋白的表达均显著升高。SiRNA转染EC9706后能够显著下调HIF1α的基因表达，同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论 缺氧促使EC9706细胞HIF1α在蛋白水平表达升高，并通过转录激活VEGF的机制调控食管鳞癌血管生成。 【关键词】 食管鳞癌;乏氧诱导因子1α;血管内皮生长因子;双链RNA;RNA干扰 恶性肿瘤快速生长和肿瘤内部血液供应相对不足导致肿瘤内部形成缺氧微环境。低氧是实体肿瘤微环境的基本特征之一。缺氧条件下，肿瘤细胞内许多基因的转录和表达发生变化，对缺氧作出应激反应。引起肿瘤的侵袭性增加和对放化疗的抗拒性增加，而在这个过程中转录因子乏氧诱导因子1 （hypoxiainducible factor 1 alpha,HIF1α）起中枢纽带作用1。乏氧引起的一些酶或因子的变化大多是通过HIF1α起作用。其在食管癌血管生成中的调控作用，尚未见详细报道。本研究以食管鳞癌细胞系EC9706为研究对象，通过体外模拟肿瘤缺氧微环境，利用RNA干扰技术观察小干扰RNA转染EC9706细胞前后低氧条件下HIF1α和VEGF的表达，初步探讨HIF1α在缺氧条件下对食管癌血管生成的调控作用。 1 材料和方法 1.1 材料 食管鳞癌细胞系EC9706由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验王明荣教授惠赠。HIF1α siRNA(h)、Control siRNAA 、siRNA转染试剂及HIF1α抗体均购自Santa Cruz公司。RTPCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，VEGF抗体购自武汉博士德公司，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术公司 1.2 方法 1.2.1 细胞体外乏氧培养条件的建立 EC9706细胞用含10%新生牛血清的RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。化学缺氧剂CoCl2加入培养基的终浓度为75μmol/L，用于模拟肿瘤内部缺氧微环境。 1.2.2 半定量RTPCR检测mRNA表达 EC9706细胞于低氧条件下培养8h，Trizol法提取细胞总RNA，逆转录反应体系（20μl）组成为：DEPC水7μl，5×Buffer 4μl，dNTPs（10nM）2μl，Oligo（dT）1μl，RNase抑制剂 1μl，总RNA 4μl，逆转录酶1μl，37℃ 5min， 42℃ 1h，70℃10min灭活逆转录酶。PCR引物序列如下：HIF1α上游5′ CCT GCA CTC AAT CAA GAA GTT GC 3′，下游5′ TTC CTG CTC TGT TTG GTG AGG CT 3′（618bp）；VEGF上游5′ CAC ATA GGA GAG ATG AGC 3′，下游5′ CCG CCT CGG CTT GTC ACA 3′（230bp）；βactin上游5’ CAT CCT GCG TCT GAC CT 3’,下游5’ TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3’(480bp)。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，数码照相并行灰度值分析。 1.2.3 免疫组化SP法检测低氧条件下HIF1、VEGF蛋白的表达 缺氧处理8h后收获细胞爬片，4%多聚甲醛固定10min，按照试剂盒说明进行。HIF1α、VEGF多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，SP试剂盒购自中杉生物技术有限公司。 1.2.4 siRNA转染EC9706细胞 转染前24h 以 4×105/ml密度接种细胞于6孔培养板，待细胞生长至60%～70%融合时进行转染。按试剂盒说明进行。分别设siRNA转染组及Control siRNA组。转染32h后，更换含化学缺氧剂CoCl2培养基继续培养8h，收集细胞进行相关指标检测。 1.2.5 HIF1α基因沉默效果的测定 低氧培养4、8h后，分别提取未转染组、转染阴性对照组和转染组的细胞蛋白考马斯亮蓝蛋白定量。10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，380