Smad4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定论文.docVIP

　　Smad4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定论文 季国忠，张发明，翟惠虹，范志宁，樊代明，王学浩 【关键词】 慢病毒 Construction and identification of lentiviral vector of RNA interference of Smad4 gene 【Abstract】 AIM: To construct a lentiviral vector of RNA interference (RNAi) of Smad4 gene. METHODS: The effective sequence of siRNA targeting Smad4 gene ed in our previous study. The plementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence oter and green fluorescent protein (GFP). The resulting lentiviral vector containing Smad4 shRNA ed LVshSmad4, and it ed by PCR and sequencing. 293T cells ad4，pCMVdR8.74 and pMD2G. All virus stocks phosphatemediated transfection. The titer of virus onstrated that the lentivirus RNAi vector of Smad4 (LVshSmad4) producing Smad4 shRNA ad4 ad4; Neoplasms; Lentivirus 【摘要】 目的：构建Smad4基因RNAi慢病毒载体. 方法：针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNAlentivectors.php）. 该病毒包装系统由pLVTHM，pCMVdR8.74和pMD2G 3质粒组成，其中pLVTHM含有能持续表达小RNA的元件，同时能表达绿色荧光蛋白（GFP）. pCMVdR8.74和pMD2G含有病毒包装所必须的元件. 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、大量质粒DNA提取试剂盒（Qiagen公司). 1.2方法 1.2.1构建表达shRNA慢病毒载体用Ambion公司的设计软件，设计、合成3对针对Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列. 经分别构建质粒，转染293细胞，据其对Smad4的抑制率，确定有效靶序列：5′GTACTTCATACCATGCCGA3′，（Smad4 mRNA第1848位，GenBank gi. 设计并合成（上海吉凯基因化学技术公司）其shRNA的DNA Oligo：5′CGCGTCCCCGTACTTCATACCATGCCGATTCAAGAGA TCGGCATGGTATGAAGTACTTTTTGGAAAT3′（内含MluI和ClaI酶切位点，下划线所示.tronolab.lentivectors.php）. 经退火形成双链DNA，与经MluI和ClaI双酶切后的pLVTHM载体连接，转化DH5大肠杆菌，挑取重组阳性克隆行PCR及测序鉴定（上海博亚生物技术有限公司）. PCR鉴定阳性克隆的primer: Up: 5′GTGTCACTAGGCGGGAACAC3′；DoL的细胞培养皿，37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养，细胞密度达60%～70%时转染. 制备慢病毒包装系统中3种质粒DNA溶液（LVshSmad4 20 μg，pCMVdR8.74 15 μg，pMD2G 7.5 μg），无菌水定容至1800 μL, 再加入CaCl2 (2.5 mol/L) 溶液200 μL，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000 μL，室温放置20～30 min. 将DNA磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12 h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15 mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次. 然后每瓶细胞中加入含100 mL/L小牛血清的细胞培养液15 mL，继续培养48 h. 收集转染72 h的293T细胞上清液. 于4℃，4000 g离心10 min；以0.45 μm滤器过滤后置于40 mL超速离心管中，4℃，25 000 r/min离心20 min；而后以冰PBS液重旋病毒沉淀，于4℃溶解过夜. 次日，以10 μL每管分装病毒液置于-70℃冰箱中保存. DMEM培养液重悬293T细胞至5×108/L, 在96孔板每孔中加100 μL重悬细胞. 取6个e