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第十三章 基因重组与分子生物学技术 第二节 基因重组技术 基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 一、 基因工程主要步骤 ①载体和目的基因的分离； ②载体和目的基因的切断； ③载体和目的基因的重组； ④重组DNA的转化和扩增； ⑤重组DNA的筛选和鉴定。 二 重组DNA中的工具酶 1、限制性核酸内切酶 可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA，被称为基因工程的手术刀 (一)、限制性核酸内切酶的命名（自学） 按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzae d)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。 （二）、限制性核酸内切酶的分类 （自学） 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ三类： Ⅱ类限制性核酸内切酶的特点： （自学） 1、只有限制性活性，无甲基化修饰活性。 2、切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。 3、仅需Mg?2+参与，无需ATP。 是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。 三 基因工程载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 1．质粒： （自学） 是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。 质粒pUC19的分子结构 2．噬菌体： （自学） 可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。 第三节 基因重组基本过程 （自学） 基本过程 一、目的基因的获得 1、化学合成法： 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 2．从基因组DNA分离 3、从基因组文库中筛选： 将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。 基因组文库的制作 4、从mRNA合成cDNA： 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。 五．利用PCR合成： 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。 二、 载体和目的基因的连接（接） 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。 ? 载体DNA与目的基因的连接 2、平端连接 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。 3、 接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。 4、 人工接头连接法： 将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。 四、重组DNA分子导人受体细胞 重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过转化（transformation）方式导入宿主细胞，即将大肠杆菌