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DNA 切割与连接 DNA的切割和连接 DNA的切割 限制性 内切酶 宿主修饰的限制内切 DNA 切割连接的几种情况 大肠杆菌Dam和Dcm甲基化酶 酶质量的重要性 连接DNA分子 衔接体 同聚加尾 连接聚合酶链式反应产物 把引物5’端的多余序列引入扩增的DNA 不需要DNA分子连接酶的DNA分子连接法 DNA 切割 切割DNA分子发展史 微生物的限制修饰现象早在1952年就已被发现； 1962年Arber(瑞士巴塞尔生物研究中心)提出限制修饰理论来解释这一现象,1968年在大肠杆菌B中提出了型限制酶Eco B； 1970年,美国霍普金斯大学的H.Smith等人从流感嗜血菌Rd中纯化了型限制酶。 Arber和H.Smith获得了1978年度诺贝尔奖。 限制酶到目前已发现200多个类别2500种。 影响DNA在宿主细胞的存活引出修饰 宿主控制的限制和修饰 噬菌体涂板于特定宿主菌株的效率，取决于它前次是在什么菌株中繁殖的。 修饰： 由第二个宿主菌株导致噬菌体发生非遗传性变化，重新涂抹该菌不在受限制。 也可见于一个菌株到另一个菌株中 限制内切类型/命名/限制片断的数量和大小 DNA切割连接的几种情况非同一种限制内切酶也可组合成，只要黏性末端相吻合就可以。 大肠杆菌Dam和Dcm甲基化酶 由dam基因编码的甲基化酶把S-腺苷甲硫氨酸的甲基基团转移到GATC中腺苷酸的位置上。Dcm基因编码的甲基化酶在C5位置修饰CCAGG和CCTGG内部的胞嘧啶残基。 特点一： 从某种表达Dcm或Dam甲基化酶的菌株中分离到的某限制性内切酶部分或所在位点可能抗该限制性内切酶。 特点二： 质粒DNA受修饰状太可能影响特定情况下转化的发生绿。 酶质量的重要性 提纯和去污染，分子筛。 QC检测—蓝白筛选分析 DNA分子链接 DNA连接酶 大肠杆菌杆菌噬菌体T4编码的一种酶：DNA连接酶，它可以填补DNA链中两个相邻核苷酸之间 单链缺口。尽管大肠杆菌的酶他们分别催化的反应都十分相似，但他们所需要的辅基是不同的。 T4需要ATP而大肠杆菌需要DAN。 当黏性末端的限制性内切酶所造成的末端相结合时，相接处有在两条链上相距几个碱基对的缺口。DNA连接酶可以修补这些缺口形成一个完整的双螺旋。体外用纯化的DNA连接酶进行这个反应，是许多基因操作程序的基础。 链接反应的影响因素 酶切方式 载体供体浓度比例 链接缓冲液 PH ATP浓度 链接温度和时间 DNA浓度 DNA序列 衔接体 Your subtopic goes here 同尾加聚 PCR反应产物 不需要DNA链接酶的方法 Thanks!! Elements