PCR聚合酶链式反应—培训课件.pptVIP

PCR反应程序 95℃ 5min 1个循环 95℃ 30sec 35个循环 60℃ 30sec 72℃ 30sec 72℃ 10min 1个循环 4℃ hold ? 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中 电荷效应 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中 分子筛效应 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。 线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系 琼脂糖凝胶的百分浓度（%） 线状DNA分子的有效范围（Kb） 0.3 60~5 0.6 20~1 0.7 10~0.8 0.9 7~0.5 1.2 6~0.4 1.5 4~0.2 2.0 3~0.1 实验材料 【材料】 1. 琼脂糖 2. 10mg/ml EB 3. marker 4. TAE Tris 242g CH3COOH 57.1ml 0.5M EDTA（pH8.0） 100ml ddH2O to 1000ml 实验步骤 【步骤】 1、称1.5g琼脂糖，加100ml电泳缓冲液（1×TAE）加热熔化。 2、胶液冷却至60℃时，加入4μl EB，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。 3、待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于水平电泳槽中，加入1×TAE，让液面高于胶面至少1mm。 4、上样。 5、接通电泳仪电源，1-5V/cm电压（一般80~100V），开始电泳。 6、根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电源后，取出凝胶，使用凝胶成像仪进行观察或拍照。 琼脂糖凝胶电泳DNA回收 实验原理 离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种特殊的硅基质滤膜，这种滤膜在低PH值、高浓度盐（盐酸胍，NaI, NaClO4等）存在的条件下，可以选择性吸附DNA片段，而蛋白质和其它杂质不会被吸附。再通过一系列漂洗、离心等步骤将残留的引物、核苷酸、蛋白质等杂质去除。最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。 利用硅基质膜的过滤吸附操作，大大简化了核酸纯化过程，提供了一种快速、高通量的纯化方式。除单管离心柱外，已经有96孔板、384孔板等核酸纯化产品。 目前，硅基质膜吸附法已经成为目前核酸分离纯化最主流的技术。通过该技术纯化的DNA片段可直接用于的酶切、连接、测序、标记和杂交等各种常规分子生物学操作。 试剂盒组成及储存方法 名称 用途 溶胶/结合液 DA 溶胶（红色） 结合液DD 无色 与DA混合后变为黄色 洗涤液W1 洗涤液 去盐液W2 洗脱盐离子（75% EtOH） 洗脱液EB 洗脱DNA 吸附柱 AC 结合DNA 收集管 （2ml） 收集废液 实验步骤 注意事项 切胶回收DNA时，应尽量使用能量较低的长波长紫外线，并缩短操作时间，以减少紫外线对DNA的损伤。 第一次使用前先在漂洗液W2中加入指定量的无水乙醇，加入后及时做好标记，以免多次加入。 各种溶液使用后应及时盖紧，以避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化。 所有操作在室温完成。若溶液沾染皮肤、眼睛时，立即用大量清水冲洗。 适当减小洗脱体积可提高回收DNA的浓度。但体积小于30μl将降低洗脱效率。 凝胶电泳检测 第一章 PCR技术原理 定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。 PCR技术: PCR概念的提出 1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 1983，Kary Mulli