靶向bcl2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立论文.docVIP

　　靶向bcl2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立论文 沈方臻 林明刚 肖文静 王宁宁 【摘要】 目的 构建针对bcl2基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体，转染到bcl2基因高表达的胃癌细胞株SGC7901中，并筛选出稳定低表达bcl2基因的细胞株。方法 针对bcl2基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列，插入质粒载体pGPH1／GFP／Neo中，经脂质体介导转染SGC7901细胞。RTPCR检测bcl2基因在mRNA水平的变化, MTT 法检测bcl2基因沉默后胃癌SGC7901细胞的增殖情况。基因沉默效果最好的一组,经G418筛选以得到稳定表达株。结果 与对照组相比，转染成功后的细胞bcl2基因在mRNA水平均显著下降， 细胞增殖速度明显降低（t=2.41,P 0.05）;并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆。结论本研究成功利用针对bcl2基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl2基因的SGC7901细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础。 【关键词】 基因,bcl2；RNA干扰；质粒 ［ABSTRACT］ Objective To construct a short, bcl2 genetargeting hairpin RNA (shRNA) plasmid vector, ids. The vectors ine. RTPCR ployed to detect the proliferation of tumor cells after bcl2 gene RNA expression of bcl2 in the transfected cells RNA, id vector. The present study provided basis for research on gene therapy of gastric cancer. ［KEY TT)购自美国Sigma公司；上下游引物由上海生物工程有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 靶向bcl2基因shRNA表达载体的构建根据siRNA的设计原则及质粒载体pGPH1／GFP／Neo的特点，使用BLAST将选定的序列和相应的人基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列EST同源的序列，选择4条片段作为bcl2基因干扰片段并设计1条乱序非编码片段作为阴性对照，分别为：位于35～55 bp的GGGAGATAGTGATGAAGTACA，位于354～372 bp的GCTGCACCTGACGCCCTTC，位于435～455 bp的GAGGATTGTGGCCTTCTTTGA，位于527～550 bp的GGATGACTGAGTACCTGAACCGGC，阴性对照为GTTCTCCGAACGTGTCACGT,设计完成后送上海生物工程有限公司合成,得到重组质粒分别命名为pGPH1/GFP/Neobcl 2 shRNA1、pGPH1/GFP/Neobcl 2 shRNA2、pGPH1/GFP/Neobcl 2 shRNA3、pGPH 1/GFP/Neobcl 2 shRNA4以及pGPH1/GFP/NeoshNC，经上海英骏生物技术有限公司进行测序,显示载体构建正确。 1.2.2 细胞培养及转染 胃癌SGC7901细胞株置于含体积分数0.10胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37 ℃、含体积分数0.05 CO2细胞培养箱中常规培养，取对数生长期细胞进行实验，以2.5 g/L的胰酶消化传代。按照Lipofectamine 2000说明书进行转染。实验分为阳性干扰组:转染特异性质粒pGPH1/GFP/Neobcl 2 shRNA1～4；阴性对照组:转染非特异性质粒pGPH1/GFP/NeoshNC；空白对照组:未转染质粒。 1.2.3 RTPCR检测bcl2 mRNA的表达 收集以上各组细胞，提取总RNA。取RNA 5 μL，合成cDNA，再PCR扩增。bcl2引物序列：P1(上游)5′GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG3′, P2(下游)5′GGTGCCGGTTCAGGTACTCA3′, 扩增产物长为116 bp；同时选取GAPDH 作为内参照,GADPH 引物序列：P1(上游)5′CTGCACCACCAACTGCTTAG3′,P2(下游)5′TGAAGTCAGAGGAGACCACC3′, 扩增片段长度为407 bp。PCR反应参数：94 ℃变性4 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33个循环； 72 ℃延伸7 min。于15 g/L的TAE琼脂糖凝胶上电泳