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第28卷 第4期 热 带 作 物 学 报 Vo1．28 No．4 2007年 12月 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS DeC．20O7 番木瓜果实膨胀素基因部分序列的克隆及分析 牛艳梅 沈文涛 卢雅薇 周 鹏’ 蓑谨翥热带生物技术国家重点实验室 蓄 釜嚣 海口571101 摘 要 膨胀素(Expansin)是一类存在于植物细胞壁上，并能快速缓冲张力，使植物细胞壁松驰的蛋白质。以 成熟番木瓜果实总RNA反转录得到的cDNA为模板，设计简并引物进行PCR，得到1个大小为531 bD的基 因片段，编码177个氨基酸，并存在expansin的保守区域，命名为Cp—EXP1。番木瓜expansin的成功克隆为研 究番木瓜的生长发育以及其品种的改良等打下了良好的基础。 关键词 番木瓜果实 expansin 基因克隆 序列分析 中图分类号 $677．9 Q785 Expansin中文译名为膨胀素，又称膨大素、扩张蛋白。它存在于植物细胞壁上，能缓冲细胞壁结构网 张力使其变得松驰，从而快速缓冲细胞壁张力的活性蛋白质，但其本身并不具有水解酶、糖基转移酶等 酶的结构特征和功能 【 z-。在目前研究的细胞壁蛋白中，它是唯一能在体外诱导细胞壁扩张的蛋白【 。 Expansin在植物生长发育及对外界环境的反应中起重要作用，如细胞膨胀、分离，器官脱落，花粉管向柱 头侵入和伸长，果实生长发育及后熟软化。研究结果表明，expansin的积累量与胚轴【”、胚芽鞘【 、节 、叶 片【 】和根系【 】等的生长有关。目前国外已克隆出多种植物的expansin基因，特别是对果实expansin与果 实生长发育、后熟软化关系的研究。如草莓【 、芒果【 、蕃茄【 m】。国内对expansi基因的报道较少，主要集 中于对棉花[11-131和大豆幼苗[】 】的研究，果实方面近几年也涉及到了荔枝[15】和香蕉【 】，但尚未有关于番木 瓜expansin基因的报道。番木瓜(Car／ca papayaL．)是著名的热带水果，为番木瓜科(Caricaceae)番木瓜属 (Carica)多年生常绿大型草本植物，广泛栽培于全世界的热带和亚热带地区，至今已有300多年的栽培 和食用历史。番木瓜的营养价值高，其富含维生素C和木瓜蛋白酶，能有效地预防肠道疾病，被营养学 家誉为“十种最佳水果”之一；番木瓜作为一种果菜兼用优良作物，是理想的植物生物反应器。因此，对 番木瓜果实expansin基因的研究，不仅在揭示果实成熟软化的生理机制方面具有重要的理论意义，而且 对于实践中通过基因工程达到人为调控这个过程，获得耐贮藏的、品质优良的新品种方面具有重要的 实践意义。 1 材料与方法 1．1 材 料 供试的番木瓜采自本室的试验地，品种为蔬罗Ⅱ号。RNA提取试剂Trizol购自Invi~ogen公司， E．coli DH一5or为转化受体菌(由本实验室保存)，克隆载体pMD一18T购自Takara公司，琼脂糖凝胶回收 试剂盒回收试剂盒购自TIANGEN公司，PCR引物由赛百盛公司合成，RNA PCR Kit购自Takara公司。 1．2 总RNA的提取 总RNA的提取使用Trizol试剂，具体操作按产品说明书进行。 1．3 引物设计与合成 根据基因库中已登录的expansin氨基酸保守序列设计引物。上游引物序列是：5 一GSN CAYGCNA CNTTYTAYGGNG一3 ，下游引物序列是：5 一YTGCCARTTYTGNCCCCA RTT一3 ，其中S=G／C，Y=C／T， R=A／G。N=A／G}C o 牛艳梅 女，1982年生，硕士研究生。 ‘通讯作者，周 鹏，男，1963年生，教授、研究员。E—mail：zhp6301@126．corn 收稿日期：2006—08—10 修回日期：2007—01—29 48 热 带 作 物 学 报 28卷 1．4 cDNA克隆及序列分析 取成熟的番木瓜果肉KNA反转录合成单链cDNA，条件为42℃30 rain，99℃5 min，5℃5 min。 得到的cDN