蛋白质的共价结构-101022.pptVIP

蛋 白 质 化 学 （1）胰蛋白酶：最常用的蛋白水解酶 作用特点：当B=Lys或者Arg时，胰蛋白酶发挥水解作用。 胰蛋白酶水解后产生的肽段数＝多肽链中Arg和Lys总和 + 1 ……-A-BC-D-…… N-末端 C-末端 （酶切位点） 在蛋白质和多肽分子中除肽键外，也常见两个Cys（半胱氨酸）残基侧链之间形成-S-S-使两条单独的肽链交联起来（链间二硫键），或使一条肽链的某一部分成环（链内二硫键）。 肽分子中的二硫键 链内二硫键 链间二硫键 四、肽的物理和化学性质(P165) 物理性质： 短肽晶体为离子晶体，熔点很高。 化学性质：游离α-NH2 、α-COOH和R基可发生与AA中相应的基团类似的反应。 ① 肽定性、定量：--NH2末端的AA残基也能与茚三酮发生定量反应形成显色物质。 ② 双缩脲反应：肽、蛋白质特有，含两个或两个以上肽键均可发生。可定量。 五、一些天然存在的肽(P167) 生物活性肽： 谷胱甘肽 神经肽：脑啡肽、内啡肽、强啡肽、P物质、Y肽 肽类激素：催产素、加压素等 其他：生长因子；短杆菌S；甜味肽等 GSH（还原型谷光甘肽）在红细胞中作巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和红细胞其它蛋白质的Cys残基处于还原态。 还原型 氧化型 第三节 蛋白质的一级结构及其测定 蛋白质的分子结构包括： ：共价结构 一、 蛋白质的一级结构概述 一级结构：是指蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序。 一级结构的连接键： 肽键（主要）、二硫键 蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子基础； 蛋白质的一级结构决定它的空间结构； 氨基酸序列的改变可以导致蛋白功能异常和疾病； 一级结构的重要性： 二、蛋白质一级结构的测定的基本步骤 提纯待分析的蛋白质样品（测定蛋白质分子量） 测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质分子的多肽链 断裂多肽链内的二硫键（--S—S--） 分析每一多肽链的AA组成（组成肽链的氨基酸种类和每种氨基酸的数目） 测定多肽链N-末端和C-末端残基 多肽链的部分裂解及肽片断的分离 测定各肽段的氨基酸序列 确定各肽段在多肽链中的位置 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置 （一）提纯待分析的蛋白质样品 二、蛋白质一级结构测定各步骤的目的方法及注意事项 样品要求：均一样品，纯度﹥97%，知道相对分子量Mr，误差允许在10%左右。 提纯步骤：脱脂－适当溶剂进行抽提－透析、超滤－层析、离心－电泳。 样品纯度的鉴定方法：电泳，等电聚焦，末端测定，亲和层析，离子交换层析等 样品纯度的鉴定原则：通常以电泳时呈现一条区带，或者末端残基测定结果为一种残基时的样品做为序列测定的样品。 附：蛋白质分子量的测定： 测定分子量的目的：1：估计序列测定工作量的大小。 2：为了计算蛋白质的氨基酸定量组成。 测定分子量的方法：1：凝胶过滤法。 2：SDS法。 3：沉降分析法。 （二）测定蛋白质分子中多肽链的数目 根据蛋白质N-末端或C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子量可以确定蛋白质分子中多肽链的数目。 目的：如果一个蛋白质分子含有多个不同的多肽链，则需要分开分别测定。如果只有一条肽链或者是由多个相同的多肽链组成，则不必逐一测定。 常用方法：1：SDS法。 2：末端测定法。 （三）拆分蛋白质分子的多肽链 如果蛋白质分子是由一条以上多肽链构成的，则这些链必须加以拆分，破坏亚基之间的共价键。 拆分办法： 寡聚蛋白质由变性剂处理变成各个亚基。 如多肽链间通过二硫键相连，则用氧化剂或还原剂打开。 （四）二硫键的断裂 (P171) 化学处理方法常有两种： 过甲酸氧化 巯基乙醇还原 1.巯基乙醇还原 (P172 图4-8) 利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。当高浓度的巯基乙醇在pH8条件下室温保温几小时后，可以使-S-S-定量还原为SH。 注意：此反应是可逆的，因此要使反应完全，疏基乙醇的浓度必需在0.1-0.5摩尔。 R-S-S-R’ 巯基乙醇 PH=8-9 RSH+R’SH+HO(CH2)2S-S(CH2 ) 2OH 2.过甲酸氧化 用氧化剂过甲酸断裂-S-S-。这个反应一般在0℃下进行2小时左右，两个S就全部能转变成磺酸基，这样被氧化的半胱氨酸转变为磺基丙氨酸。 R-S-S-R’ HCOOOH -10℃ RS