酶联免疫法测定人碱性成纤维细胞生长因子脂质体的包封率.pdfVIP

第36卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报 第4期 2008年4月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 521—524 酶联免疫法测定人碱性成纤维细胞生长因子脂质体的包封率 黄亚东¨ 张宏波2 赵文1 苏志坚2 曲红艳3 项琪1 张卉1 ‘(暨南大学医药生物技术研究开发中心。广州510632) 2(深圳致君制药有限公司，深圳518029)3(南海朗肽制药有限公司，佛山528222) 摘要建立了一种灵敏的定量检测人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)脂质体中hbFGF含量的酶联免疫 (ELISA)方法，应用于测定hbFGF脂质体的包封率。通过用hbFGF标准品溶液包被酶标板，加入特异性的鼠 抗人hbFGF抗体(一抗)和山羊抗鼠IgG(二抗)，采用多因素棋盘滴定方法确定最佳实验条件为：一抗浓度 复性良好。本方法测定hbFGF脂质体超滤液和氯仿提取液中hbFGF含量分别为(3．3254-0．193)州L和 (18．454 性高、重复性好、快速、简便，可用于hbFGF脂质体包封率及其它含hbFGF制剂的含量测定。 关键词酶联免疫法，人碱性成纤维细胞生长因子，脂质体，包封率 1 引 言 basicfibroblast 人碱性成纤维细胞生长因子(human growth 成的阳离子多肽(分子量16—18kD，等电点为9．6)，广泛分布在体内各组织器官中。hbFGF是一种很 强的丝裂原，具有促进各种软组织损伤修复、加速肌肉及毛细血管的生长分化和神经组织再生等作 用¨。】，具有重要的药物开发价值。脂质体物作为蛋白多肽类药物的载体，具有增加蛋白多肽类药物体 内外稳定性、体内缓释延长半衰期及靶向治疗作用等优势HJ。包封率是脂质体质量评价的一个重要指 辅料的干扰，给脂质体包封率的测定带来了困难”】。传统的SDS检测方法粗放，不适用于定量分 析。另外，由于hbFGF蛋白自身的紫外吸收弱，且无明显特征吸收峰的原因，应用高效液相色谱 (HPLC)法检测灵敏度较低【6J，无法满足实验要求。目前，文献报道的hbFGF的间接酶联免疫实验 7|、细胞上清液埔1的检测。未见有关于hbFGF新剂型中含量测定的系 (ELISA)检测方法主要用于血清o hbFGF新剂型开发中的定量分析提供参考。 2实验部分 2．1仪器与试剂 3K30高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，MR 国Costar公司)。超滤离心管(美国Millipore公司，截留分子量100kD)。hbFGF(纯度90％，1．0g／L， 抗，2g／L，武汉博士德生物工程有限公司)，邻苯二胺(OPD)(化学纯，天津化学试剂厂)。 2．2实验方法 2．2．1hbFGF ELISA分析方法的建立采用多因素棋盘滴定法一J，确定一抗的种类，hbFGF浓度范 9．6)将hbFGF标准 围，以及一抗、二抗的反应浓度等。实验步骤如下：(1)以Na2C03包被缓冲液(pH 2007．084)5收稿；2007．1l一18接受 (No．2004资助 ． ·E-mail：ydhums2004@126．corn 522 分析化学 第36卷 ng， 品稀释为不同浓度，包被酶标板；每孔100斗L，设计每孑L的抗原量分别为10．0、1．0、0．1、O．02、0．01 以等量PBS加入包被液作为空白孔，用封条覆盖酶标板，4oC下放置过夜。(2)用PBS内含0．05％(体 积分数)Tween-20溶液洗板4次(下同)。(3)每孔加入300“LPBS-3％(质量分数)脱脂奶粉-5％(质 量分数)葡萄糖溶液，封条覆盖酶标板，于37℃恒温1h，洗板。(4)加入一抗(hbFGF鼠抗人多克隆