罗格列酮延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展.docVIP

　　罗格列酮延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展 【摘要】 目的： 观察罗格列酮对糖尿病大鼠钙化血管的治疗作用及对骨转录因子Msx2表达的影响。方法： 在高脂饮食加小剂量链脲佐菌素腹腔注射处理的基础上，加用维生素D3和尼古丁处理，制备糖尿病合并血管钙化大鼠模型(糖尿病合并血管钙化组)，给予部分糖尿病合并血管钙化组大鼠罗格列酮灌胃 (2 mg·kg-1，每天1次，共8周)处理(罗格列酮组)，同时设立空白对照组。实验第21周末，处死各实验组大鼠，检测各组大鼠的代谢指标，进行血管 von Kossa染色，检测血管钙含量和碱性磷酸酶活性，应用realtime PCR方法检测 Msx2 mRNA 及蛋白免疫印迹方法检测 Msx2 蛋白在血管中的表达变化。结果： 与对照组相比，糖尿病合并血管钙化组大鼠血管内存在弥漫性的钙盐沉积，血管内钙含量增高,碱性磷酸酶活性增强，Msx2 mRNA和蛋白表达明显增高 (均Plt;0.05);而给予罗格列酮处理后，钙盐在血管内的沉积明显减少，钙含量和碱性磷酸酶活性分别下降8.37%、10.59%，Msx2 mRNA和蛋白表达也分别下降 36.73 %、 42.55 %(与糖尿病合并血管钙化组相比,均Plt;0.05)。结论： 罗格列酮可以延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展，并可以减少钙化血管中Msx2的表达。 【关键词】 2型糖尿病; 血管钙化; 转录因子 Msx2; 罗格列酮; 大鼠 与非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者易于发生大血管钙化。血管钙化是指钙磷病理性地沉积在血管壁上。根据其在血管壁上沉积的部位不同，分为内膜钙化和中膜钙化。目前中膜钙化已经成为心血管疾病死亡率的独立预测因素[1]。中膜钙化主要表现为沿中膜弹力层的钙盐沉积，导致血管僵硬度增高和顺应性下降。血管僵硬度的增高则进一步导致心脏做功、脉搏压和脉搏波速度增加，最终引起血管膨胀受损，左室肥厚和冠脉灌注减少[2]。Msx2(msh homeo box homolog 2)是骨形成蛋白2(bone morphogeic protein2, BMP2)下游的一个转录因子，主要调控膜内成骨的发生。Cheng等[34]研究结果显示，Msx2可以调节血管外膜的成肌纤维细胞向成骨样细胞表型分化，诱导血管钙化的发生。本实验即通过建立糖尿病合并血管钙化的大鼠动物模型，观察罗格列酮对于糖尿病大鼠钙化血管的治疗作用及对Msx2表达的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　6周龄雄性 sx2 山羊抗大鼠多克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司，βactin兔抗鼠多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 和兔抗山羊 IgG 购自北京中衫金桥生物技术有限公司;ECLPlus 检测试剂盒购自英国 GE Healthcare 公司;所用其它试剂均系市售分析纯产品。 　　1.2 动物模型制备 　　将30只雄性 g·kg-1)，建立2型糖尿病模型。对照组大鼠予等量柠檬酸钠溶液腹腔注射。 1周后参照Niederhoffer等[5]报道的方法，对糖尿病合并血管钙化组和罗格列酮组大鼠制备钙化模型：上午8:00给予维生素D3 (300 000 U·kg-1)肌肉注射，尼古丁溶于花生油(质量浓度为25 mg·kg-1)按5 ml·kg-1灌胃，晚上20:00给予尼古丁重复灌胃1次。予对照组大鼠等量生理盐水肌肉注射和单纯花生油灌胃处理。4周以后，给予罗格列酮组大鼠罗格列酮2 mg·(kg·d)-1灌胃8周，予糖尿病合并血管钙化组和对照组大鼠生理盐水灌胃。于实验第21周末，注射过量戊巴比妥钠处死动物，经心脏采血留取血标本，摘取胸、腹主动脉用生理盐水冲洗后称质量，于-80 ℃贮存备用。 　　1.3 代谢指标检测 　　各组大鼠的血糖 (glucose, Glu) 通过葡萄糖氧化酶法检测，利用 Randox 公司的比色法试剂盒检测血总胆固醇 (cholesterol, Cho) 和甘油三酯 (triglyceride, TG) 含量，血胰岛素 (insulin, Ins) 水平利用Linco公司的放免试剂盒检测。所有操作重复3次。 　　1.4 von Kossa染色 　　取大鼠胸主动脉段约0.5 cm，在10%福尔马林溶液中固定后石蜡包埋，制作6 μm厚切片，常规脱蜡、脱水。浸入5%硝酸银溶液，在日光下照射30 min后用蒸馏水清洗数遍，将切片置于5%硫代硫酸钠溶液中1 min后蒸馏水清洗数遍，用1%伊红染色复染数秒钟。脱水、透明后封片，光镜观察，拍照。 　　1.5 钙含量和碱性磷酸酶活性检测 　　取主动脉组织(约 10 mg)于 55 ℃彻底烘干，加入 10%甲酸(按 30 μl·mg-1 组织干重)，4 ℃过夜。按照钙检测试剂盒说明书操作，