饲料分析与检测实验：饲料中细菌总数的检验 免费.docVIP

实验十二 饲料中细菌总数的检验 【学习目标】 掌握饲料原料及配合饲料细菌总数的检验方法，并能用该方法检验各类饲料细菌总数。 一、原理 将试样稀释至适当浓度，用特定培养基在30.0℃下培养72.0±3h，计数平面中长出的菌落数，可计算出每克样品中的细菌数量。 二、检验方法 （一）培养基和稀释液 1.稀释液 称取NaCl(GB 1266)8.5g、蛋白胨1.0g、蒸馏水1000.0ml，加热溶解校正pH使其灭菌后保持7.0左右，按9.0ml一支分装于试管，90.0ml／瓶分装于三角瓶中，加入数粒玻璃珠，塞上棉塞包扎后于121.0±1℃高压灭菌20.0min。 2.平面计数培养基 蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、无水D—葡萄糖 1.0g、琼脂9.0～18.0g、蒸溜水1000.0ml，混合加热溶化，校正pH使其灭菌后保持7.0左右。过滤分装于三角瓶中，塞上棉塞包扎后于121.0±1℃高压灭菌20.0min。 3.水琼脂培养基 琼脂9.0～18.0g，蒸馏水1000.0ml，加热溶化，校正pH使其灭菌后保持7.0左右，分装三角瓶中，塞上棉塞包扎后于121.0±1℃高压灭菌20.0.0min。 上述稀释液和培养基如不使用，应保存在0～5℃下，时间不超过1个月。 （二）检验程序 图3-3 饲料中细菌总数的检验 （三）操作步骤 1.采样 同“饲料霉菌检验”方法。 2.试样的稀释及培养 （1）无菌操作称取试样10.0g，放入含有90.0ml稀释液的灭菌三角瓶中，置振荡器上高频振荡3.0min混匀，制成1﹕10的均匀稀释液。 （2）用1.0ml灭菌刻度吸管吸取1﹕10稀释液1.0ml，沿管壁慢慢注入含有9.0ml稀释液的试管内(管尖端不要触及管内稀释液)振荡试管混合均匀，做成1﹕100的稀释液。 （3）另取一支1.0ml灭菌刻度吸管，按上述操作顺序做10倍稀释，每递增稀释一次，更换一支吸管。 （4）根据饲料卫生标准要求或试样的污染程度，估计选择2～3 个适宜稀释度。分别做10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管吸取1.0ml稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做2～3个培养皿。 （5）稀释液移入培养皿后，应立即将凉至46.0±1℃的平面计数用培养基(放置于46.0±1℃水浴锅)注入培养皿约15.0ml，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀，从稀释试样到倾注培养基时间不得超过15.0min。估计到试样中所含微生物可能在琼脂平面生长时，待琼脂完全凝固后，可将培养皿倒置放入46.0±1℃培养箱内培养72.0±3h取出，计数平面内菌落数目，菌落数乘以稀释倍数，即得每克试样所含细菌总数。 3.菌落计数方法 平面菌落计数时，可用肉眼观察，必要时借助放大镜观察，以防遗漏，以同一稀释度的2～3个平面菌落的平均数为结果。 （四）菌落计数的报告 选取菌落数在30～300之间的平面作为菌落计数的标准。每一稀释度采用2个平面菌落的平均数，如两个平面培养基中一个有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平面作为该稀释度的菌落数，如片状菌落不到平面的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平面后乘以2代表平面菌落数。 1.稀释度的选择 （1）应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告结果。 （2）相同的两个稀释度，其生长菌落数均在30～300之间，视二者菌落数之比决定取舍，即比值小于2，应报告其平均数；如大于2，则报告其中较小的数。 （3）所用稀释度平均菌落数300，则应按稀释度最高的平均菌落数计算；所有稀释度平均菌落数均小于30，则应按稀释度最小的平均菌落数计算。 （4）所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告结果。 （5）所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，即＞300或＜30时则应以最接近30或300的平均菌落数计。 2.报告结果 菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，数字大时可采用10的指数表示。 三、检验方法评价 这是实验室常用的细菌检测方法，该方法原理简单，但无菌操作严格，其结果准确。注意实验结束后的细菌纯培养物不可随意丢弃，应作灭菌处理，以免污染环境。 送检样品 菌落计数 选择3个适宜稀释度，各以1.0ml量加入灭菌培养皿 制作成几个适当倍数的稀释液 培养皿加入适量培养基 30.0℃下培养72.0h±1.0h 结果报告