p3 胶体电泳法 - 庄荣辉.pdf

Polyacrylamide Gel Electrophoresis P3 聚丙烯醯胺膠体電泳 莊 榮 輝 3.1 電泳原理 帶電 分子在電場中能夠移動，稱作泳動，泳動的程度稱為泳動率 (mobility) ︰ (所外加電壓 mV) × (分子之淨電荷) 泳動率 ～ ────────────────── 分子與介質間之摩擦力 上述之摩擦力，決定於此分子之大小、形狀。分子量大者摩擦力大，泳動率小；球 形分子摩擦力較小，泳動率大。而分子在環境 pH 的影響下，可能帶不同淨電荷： 當環境 pH = 分子之 pI 時，此分子之淨電荷為零 (pI 為等電點) ； 當環境 pH 分子之 pI 時，此分子之淨電荷為正； 當環境 pH 分子之 pI 時，此分子之淨電荷為負。 電泳系統中，電子由負極流向正極；帶負電的分子往正極跑，帶正電的分子往 負極跑，不帶電者則不動。大部分電泳系統的 pH 定在 8.3 ，在此pH 下凡是 pI 小 於 8.3 的分子均帶負電荷，都可以往正極跑。 3.1.1 電泳的發展 電泳需有一介質，作為電泳之場所。最早是在溶液中進行，但因在溶液擴散現 象嚴重，故改用固相的濾紙；但又因濾紙與分子間摩擦力太大，後來多改用半 固態的膠体，如聚丙烯醯胺膠体 (polyacrylamide gel) 、洋菜醣(agarose) 或澱粉 (starch) 。 蛋白質電泳以聚丙烯醯胺膠体應用最廣，其中又以膠体有無加入 SDS ，分 為 SDS及 non-denaturing PAGE (原態電泳) 。 SDS 為一種介面活性劑， 會破壞分子構形，並在分子表面均勻塗佈一層 SDS 負電分子，蛋白質分子不 論原來帶正或負電，均可往正極跑，泳動率與分子量成反比。因此 SDS 可用來測定蛋白質的分子量，但所測得的是變性狀態 (denatured) 之分子量， 與原態 (native) 分子量可能不同。不加 SDS 之 non-denaturing PAGE ，則泳動 率與其分子之電荷、分子大小、分子形狀等均有關係，較難預測。 生物化學實驗 P3-1 膠體電泳法 P3 3.1.2 聚丙烯醯胺膠体 1) 膠体組成之主要成分：聚丙烯醯胺膠体的形成，是由單体分子經聚合反應，成 為高分子聚合物，並以架橋分子，交錯連結成三次元的半固体膠体。 a) 單体 (monomer) ：丙烯醯胺(acrylamide) ，CH ＝CH －CO －CH 。 2 2 b) 架橋 (bridge) ：Bis, [N, N-methylene-bis(acrylamide)] 可看作兩個丙烯醯胺單 体分子連結在一起，可形成分叉點，以構成立體結構。 c) 自由基 (free radical) 產生者：過硫酸銨 (ammonium persulfate, APS) 或 riboflavin (即維生素BB2) 。 d) 催化劑：TEMED (tetramethylenediami