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包涵体变复性技术研究进展 - 中国医药生物技术
290 中国医药生物技术 2012 年 8 月第 7 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 2012, Vol. 7, No. 4
DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.008 ·综述·
包涵体变复性技术研究进展
罗莉,李坤,王保成,王明蓉
现代生物技术的迅猛发展使大规模表达异源重组蛋白 pH 值(通常为 12.5 ,过高可能引起蛋白降解)的变性液对
成为现实,这极大地促进了蛋白类产品的开发,尤其是重组 rhG-CSF 包涵体蛋白的溶解和复性的影响,认为高 pH 环
蛋白药物的研发。目前非糖基化的重组蛋白表达多采用大肠 境能有效溶解该蛋白,低浓度的尿素具有协同作用,并且
杆菌的原核表达系统,该系统的突出特点是表达产物多以包 2 mol/L 尿素加高 pH 值的条件没有破坏蛋白二级结构,又
涵体形式存在。与蛋白可溶性表达相比,包涵体具有产量高、 能有效减少聚集体的形成,因而更有利于蛋白的复性。另外,
蛋白稳定、容易纯化等优点,对毒性蛋白制备尤其适宜。因 Singh 等[3]研究了含有不同羟基的醇类,如甲醇、乙醇、丙
此,采用包涵体形式已成为规模制备重组蛋白产品的主要途 醇、乙二醇、丙三醇、丁醇对 hGH 包涵体蛋白的溶解,认
径之一。 为 6 mol/L 正丙醇加 2 mol/L 尿素的溶解效果最好。虽然
包涵体形成的原因普遍认为主要是外源蛋白在细胞内 此条件溶解的蛋白量比用尿素、盐酸胍强变性剂溶解的蛋白
的高表达使蛋白合成速度过快,没有时间形成正确折叠;另 量少,但此法溶解的蛋白复性率较后两者高,推测可能与该
外原核表达系统由于缺乏蛋白翻译后修饰,也容易形成包涵 包涵体蛋白在这种非变性条件下仍保有类天然态的二级结
体;培养条件如温度、pH 值、培养基成分等也是影响包涵 构有关。
体形成的因素。由于包涵体绝大多数是不溶的,没有生物活 1.2 变性方法的改进
性的,因而需要经过蛋白质变性-复性的过程以恢复其生物 包涵体蛋白的溶解通常采用一步变性法,即用含有高
活性。目前重组蛋白变复性过程中的技术难点主要在提高蛋 浓度的盐酸胍或尿素的变性溶液一次变性。2005 年,Wang
白浓度和生物活性两方面,而寻找高效、快速、低成本的变 等[4]采用两步变性法对 hIL-2/GM-CSF 包涵体蛋白进行
复性方法是该领域研究的重点。随着重组蛋白产品研发的异 变复性研究。首先用 7 mol/L 盐酸胍进行第一次变性(也
军突起,包涵体变复性技术的研究再次成为了国内外关注的 可用含 L- 精氨酸的碱性溶液代替盐酸胍进行第一次变
焦点。 性[5] ),变性后包涵体中错误折叠的蛋白被完全展开,然后
用 10 mmol/L HCl 透析除去变性液,蛋白重新聚集,再用
1 包涵体的变性 8 mol/L 尿素溶解,这样得到的蛋白溶液在之后的复性过程
包涵体因具有高密度(1.3 mg/ml)和高抗剪切力,在 中更有可能形成正确结构。而且经历了一次变性析出过程
变性前常采用高压匀浆或超声的方法破碎细菌,然后再洗涤 后,目的蛋白的纯度更高,有利于提高复性效率。2011 年
除去破碎后样品中含有的脂类、杂蛋白、核酸、脂多糖等杂 Yang 等[5]对这种两步变性一步复性方法(two-step-denaturing
质。经过洗涤的包涵体,需要进一步加入变性溶液,以破坏 and refolding method,2DR )在蛋白变复性中
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