信号肽对OPMA在枯草杆菌中的分泌表达及其催化活性的影响.pdfVIP

Vo1．34 高等 学校 化 学 学报 No．10 2013年 10月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 2334～2339 doi：10．7503／cje 信号肽对 OPMA在枯草杆菌中的分泌表达及其 催化活性的影响 李雁飞 ，张金祥 ，谷艳芹 ，郝 倩 ，曹 昊 ，张应玖 (1．吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，2．生命科学学院，长春 130012) 摘要 将编码枯草杆菌BS168的amyE信号肽 (s)的基因与编码多功能淀粉酶OPMAN和OPMA—G的基因重 组，分别构建了分泌表达多功能淀粉酶 OPMA-N和 OPMA—G的重组载体 pMA5-OPMA-SN和 pMA5一OPMA- SG，并分别在枯草杆菌BS168中实现了OPMA—SN和OPMA—SG的有效分泌表达．SDS—PAGE分析表明，该信 号肽的引入提高了异源蛋白的分泌量，OPMA—SN和 OPMA-SG的分泌水平 (53％和67％)比OPMA—N和 OPMA-G(45Zo和58％)明显提高，但此信号肽在分泌表达OPMA．N或 OPMA—G后不能被有效切除．活力分 析表明，OPMA-SN(5．17U／mg)和 OPMA—N(4．57U／mg)的活力水平与分泌水平一致，但 OPMA-SG(4．50 U／rag)和OPMA-G(4．65U／mg)的活力水平却与分泌水平呈反相关性．通过分析OPMA—SN和OPMA—SG分子 的空间构象发现，信号肽的存在不影响OPMA．N的活性部位构象，但影响OPMA—G的活性部位构象，从而导 致 OPOMA-G的催化活性下降． 关键词 多功能淀粉酶；表达；信号肽；结构；功能 中图分类号 0629．7；Q555．4 文献标志码 A 近些年在微生物体内发现的多功能淀粉酶(Multifunctionalamylase，MFA)是 ．淀粉酶家族(．Am— ylasefamily)的一类新成员，包括麦芽糖淀粉酶(Ma!togenicamylase，MAase，EC3．2．1．133)、新普鲁兰 酶(Neopullulanase，NPase，EC3．2．1．135)和环麦芽糊精酶 (cycloma1todextrinase，CDase，EC3．2．1． 54)，它们在结构上具有a．淀粉酶家族共有的4个序列高度保守的区域 (I一Ⅳ)、核心( )8桶结构 域、相同的催化位点(Asp…Glu…Asp)以及非常相似的三级结构，但在功能上与传统淀粉酶不同，它 们兼有淀粉水解酶和糖基转移酶的催化活性，可以廉价的淀粉为原料生产具有重要生理功能的分支低 聚糖(低聚异麦芽糖)，这些分支低聚糖具有双歧因子的功效，因此多功能淀粉酶在食品与医药工业中 占有重要的地位 ¨ ． 前文 已筛选出一种源 自嗜温菌Bacillussp．ZW2531—1的新型多功能淀粉酶，它可单酶催化淀 粉降解并主要产生高附加值的异麦芽三糖和异麦芽四糖 (50％以上)及少量的麦芽糖和麦芽三糖，但不 产生葡萄糖，因此将其命名为 Oligosaccharide—producingmultifunctionalamylase(OPMA)．OPMA的这些 产物特异性表明OPMA具有独特的催化多功能性和较高的工业应用价值．由于OPMA的催化产物中异 麦芽低聚糖的含量较高，更重要的是不产生葡萄糖，因此极大地提高了其产物异麦芽低聚糖作为功能 性低聚分支糖(如双歧因子)的品质和价值 J．本课题组 应用基因克隆技术已从芽孢杆菌ZW2531．1 中获得了2种多功能淀粉酶，分别命名为 OPMA．N和OPMA-G(GeneBank登录号分别为 EU368579．1 和 EU740389．1)． 鉴于OPMA-N和OPMA-G明显的工业应用优势，实现其有效的分泌表达尤为重要．枯草芽孢杆菌 是一种美国食品和药物管理局(FDA)确定的食品安全级的酶生产菌株，也是一种可分泌表达外源蛋白 的基因工程宿主菌，因此建立OPMA有效的枯草芽孢杆菌分泌表达体系具有重要意义 ．实现外源 基因在枯草杆菌中分泌表达的一个重要环节是