《分子生物学》课件-分子生物第六章.pptVIP

第六章 分子生物学技术 内容 1、 核酸提取与鉴定 2、 印迹杂交技术 3、 聚合酶链反应 4、 重组DNA技术 5、 转基因技术与基因打靶 研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA等 核酸提取与鉴定 第一节 核酸提取 总原则： 保证核酸一级结构的完整性 避免杂质污染 核酸提取过程 一、质粒DNA 质粒 (Plasmid)是游离于细菌 (及个别真核细胞)染色体DNA之外、能自主复制的遗传物质 多数是一种闭环DNA，大小为1-300kb，能够转化细菌，是基因载体 提取质粒DNA包括三个基本步骤 1·培养细菌和扩增质粒 在培养基中加入抑制剂 (例如氯霉素)可以抑制细菌的蛋白质合成，从而抑制细胞分裂，而质粒DNA会继续复制，拷贝数可达3000个，这一过程称为质粒扩增 如果要扩增的质粒DNA携带氯霉素抗性基因 (CmR)，可以用壮观霉素替代氯霉素 2·收获和裂解细菌 ①机械法:超声波、玻璃珠等（易引起DNA断裂） ②化学试剂法:十二烷基硫酸钠 (SDS)等（单用难以充分裂解） ③溶菌酶-化学试剂联合法:先用溶菌酶消化，再用化学试剂处理（最常用） 3·分离纯化质粒 关键：除去染色体DNA 质粒DNA特性： ①相对较小（仅为染色体DNA的0.1%-2%） ②闭环（染色体DNA大量断裂并且呈线性结构） 提取方法：氯化铯密度梯度分离法、碱裂解法、煮沸裂解法等 （1）氯化铯密度梯度分离法 EB分子可嵌入相邻碱基对之间，使DNA解旋 开环DNA或线性DNA存在游离末端易于解旋，可结合大量EB，DNA-EB复合物含EB越多，密度越小 闭环质粒DNA没有游离末端，不易解旋，结合少量EB，密度较大 在饱和EB条件下，质粒DNA密度比断裂染色体DNA密度大，经氯化铯密度梯度离心，可分离提取质粒DNA (2)碱裂解法（快速提取质粒DNA，收获率高） ①溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，Ph=8·0) 使菌悬浮 EDTA整合Mg2+、Ca2+以抑制脱氧核糖核酸酶 (DNase)的活性 ②溶液II（200mmol/L NaOH，1% SDS，pH=12·5)： 裂解细菌 使蛋白质、染色体DNA和质粒DNA变性 ③溶液III(3mol/L醋酸钾，2mol/L醋酸，pH=4·8) 使变性蛋白质与染色体DNA共沉淀 闭环质粒DNA复性，留在上清液中 通过离心分离提取 (3)煮沸裂解法 以溶菌酶、Triton裂解细菌，然后以沸水浴加热，不仅促进细菌裂解，还可以使蛋白质和染色体DNA、质粒DNA变性 当降低温度时，闭环质粒DNA复性留在上清液中，而染色体DNA保持与细胞膜碎片结合、沉淀，可以通过离心除去 在离心上清液中加入有机溶剂 (例如异丙醇)便得到质粒DNA粗品沉淀 二、真核生物基因组DNA 液氮冷冻组织材料，将其研成细粉 用EDTA(蟹合Ca/Mg，抑制DNase活性)、去污剂(SDS能溶解膜蛋白和膜脂，裂解细胞膜和核膜，使膜脂、蛋白质与DNA分离)和蛋白酶K(丝氨酸蛋白酶，水解由脂肪族、芳香族氨基酸的竣基形成的肽键)共同裂解细胞 用苯酚、氯仿/异戊醇等抽提除去蛋白质(氯仿可以除去DNA溶液中微量酚的污染，异戊醇可以防止蛋白质变性操作过程中产生气泡) 经乙醇沉淀进一步纯化，可获得100-200kb的DNA片段 三、真核生物RNA 最关键的是抑制RNA酶的活性(RNase无处不在，稳定并且耐高温 ) 提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备 塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用0.1%二乙基焦碳酸盐（DEPC）水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用氯仿处理) 玻璃用品： 使用前于180℃的高温下干烤6h以上，或在250℃下干烤3h以上 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再用3％H2O2室温浸泡10min，然后用0.1％DEPC水冲洗，晾干 (一)总RNA提取 1、异硫氰酸胍-氯化铯密度梯度分离法 利用异硫氰酸胍变性蛋白质，抑制RNase的活性，再进行密度梯度离心，能够获得高纯度的总RNA 适合于从冷冻时间长、细胞核不易分离及富含RNase的组织细胞内提取RNA 不适合于一般实验室应用（一次提取量有限，操作过程复杂费时，需要进行密度梯度离心） 2、异硫氰酸胍-酚氯仿法 以含4mmol/L异硫氰酸胍与0·1mmol/L巯基乙醇的溶液裂解细胞 在pH=4·0的条件下用酚/氯仿抽提裂解溶液 最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA 比1法简便、经济和高效，能同时处理多个标本，且RNA的完整性和纯度都很高 3、氯化锂-尿素法 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，氯化锂选择性沉淀RNA 缺点：存在