细胞培养无菌操作和培养技术(2010-9-25).pptVIP

练习： 铺设一个六孔板（每孔培养基1.5ml），每孔需要106个细胞，细胞计数的结果是5x107，需取多少ml细胞原液？ 本课小结 细胞无菌技术 细胞培养技术 细胞原代培养 细胞换液、消化和传代 细胞冻存与复苏 细胞计数与活力 细胞污染与控制 换液： 全量换液和半量换液 换液时机的选择： 培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄。 细胞状态 细胞换液 复苏 24h 48h 细胞生长形态变化 贴壁细胞换液： 贴壁细胞换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。 若希望细胞能在较长时间内能维持存活，并控制细胞增殖，此时要换成含 2 %小牛血清的维持液。 若镜下观察杂质较多，可考虑用PBS或D-HANK`S液冲洗。 悬浮细胞的换液： 将原培养瓶竖起，在 30 min 内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸弃一半原上清，再加入等量的新鲜完全培养基。 若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000 rpm 10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。 细胞消化 对于贴壁不太紧的细胞如293或其他半贴壁细胞，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如肿瘤细胞，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为 （以下操作均按无菌操作的要求进行）： ? 将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去； ? 加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润； ? 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化，离心。 ?? 视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。 经48小时培养后，细胞已长成致密单层。 致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状，使瓶壁呈半透明， 弃去培养液，在此可先摇动细胞瓶，使老化死亡贴壁情况不好的细胞随培养液弃去。 消化后的细胞 轻轻摇动培养瓶，细胞层呈片状从瓶壁上脱落下来，镜下观 察，细胞回缩变圆，细胞间隙增大。 加入完全培养基 2~5 ml终止消化，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械力损伤。 离心1500 rpm 5 min。 弃上清，用适量培养基稀释，调整细胞至适当浓度后再分瓶培养。 分装细胞 1、分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记（细胞名称和传代次数，培养基名称和传代时间）。 继续培养 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+，占50%为+ +占75%时为+ + +。 细胞的传代 悬浮细胞的传代 悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。 细胞的换液、消化和传代注意事项： 严格的无菌操作 适度消化 细胞的复苏和冻存 细胞冻存及复苏的基本原则是 慢冻速融 原理：细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，冰晶体积膨胀造成细胞核 DNA 空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。 试剂：常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 细胞冻存 Cryopreservation 冷冻保存要点 冷冻过程要缓慢：保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 细胞浓度控制在：5x106－2x107/ml。 常用细胞冷冻保存液 5%或10％DMSO＋完全培养液 10％甘油＋完全培养液 冻存方法 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中； 3. 离心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存