血清醋酸纤维薄膜电泳实验常见问题分析.docVIP

血清醋酸纤维薄膜电泳实验常见问题分析摘 要： 本文阐述了血清醋酸纤维薄膜电泳实验中电泳图谱常见的问题，并对产生这些问题的原因进行了分析，以期为生物化学实验教学提供参考。 关键词： 血清醋酸纤维薄膜 电泳 生物化学 实验 电泳是带电颗粒在电场的作用下，向着与带电颗粒电性相反的电极迁移的现象。电泳法可用于分离、鉴定或提纯许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等，因此电泳法已成为开展生物化学和分子生物学研究工作的一种常规的不可缺少的工具。电泳法(血清醋酸纤维薄膜电泳分离及测定)作为一项基本方法，已成为医学生生物化学实验教学常规开设的实验内容，该法操作简便，快速、价廉，样品用量少，实验技术成熟，分辨能力强，没有吸附现象、效果直观，便于保存等优点，但影响电泳图谱的因素较多，学生在实验中操作不当等，均可导致实验失败而得不到理想的电泳图谱。因此，为了达到预期的实验效果、提高学生对电泳实验的动手能力，根据我校学生血清醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis，CAME）实验的实际情况，本文对CAME实验中电泳图谱常见的问题进行分析，以期为CAME实验教学提供参考。 1.出现五条以上的区带 在CAME实验中，有的同学电泳实验结果看起来很“完美”，有“许多”区带――五条以上（实验结果应是五条区带，分别是清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白），为什么会有这种现象呢？原来出现的“许多”区带（五条以上）正是在点样中出现的，有的同学在点样过程中实施“二次”点样［１］。CAME实验包含准备、点样、平衡、电泳、染色、漂洗、定量（该步骤没要求）等步骤，其中点样成功是获得清晰电泳图谱的关键。在试验中，为了便于学生操作，我们应用玻片进行点样，有的同学没有擦干玻片两侧的血清；有的同学觉得点样量太少，又重复进行一次点样。没擦干玻片两侧的血清，导致玻片两侧有两个点样面，后者进行的“二次”点样不可能在同一个位置，在进行电泳时，有的区带“跑”得快，有的“跑”得慢，区带与区带之间有的重叠，有的未重叠，因而分离出五条以上的区带（事实上，在某一区带并不是同一种蛋白质）；有的同学进行多次（两次以上）点样所得到的电泳图谱成片。其实在实验前老师已事先提醒学生不要进行“二次”点样，并详细介绍了可能产生“二次”点样的情况，但少数同学可能没在意或认为点样量“看起来太少”，于是又重复进行点样操作。 2.没出现电泳区带或不足五条区带 有的同学电泳实验结果没有出现区带或不足五条区带主要有下面一些原因。 2.1醋酸纤维薄膜在电泳仪两极放反了。电泳是带电粒子在电场中向电性相反的电极泳动的现象，根据实验原理，点样的一侧应离负极近，而有的同学正好放反，醋酸纤维薄膜放反会导致带电的粒子在薄膜上泳动的距离过短，蛋白质“跑到”滤纸上或电泳槽的缓冲液中去了，结果也就不会出现区带或不足五条区带。 2.2点样点反了。实验要求同学们先在醋酸纤维薄膜点样处划线，但有的同学划线不清楚，结果点样时也不知道具体的位置，事实上点样没有在划线处（在与之对应的离正极近的一侧），造成与上述2.1相同的结果，也不会出现区带。 2.3点样没点上去。点样时要求同学们用力不能太大也不能太小，太大会造成醋酸纤维薄膜折断，太小有可能样品根本没点到薄膜上或在薄膜上的样品太少，出现的结果不清晰，甚至没有区带。 2.4在光滑面点样。醋酸纤维薄膜有两面，一面有光泽，一面无光泽，无光泽面才是实验要求的点样面，操作时必须认真加以区别（有光泽的一面发生的是镜面反射，无光泽的一面发生的是漫反射，以此可以区别）。若点样错误地点在有光泽面上，带电的蛋白质就不可能在薄膜上移动，也就不可能有五条区带。 2.5电压太高或太低。电泳槽两极之间的膜长度为8cm―10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4mA/cm―0.5mA/cm膜宽。当电压过大或电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起醋酸纤维薄膜缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸，不可能出现电泳的结果（在预实验中我们曾以此为对照，确实不能出现区带）。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散，导致实验结果实验图谱不清晰或成片，达不到预期的效果。在实验中，当电泳的电压或电流达不到或超过上述值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，由于扩散变宽，区带中的蛋白质泳动到滤纸桥甚至到缓冲液中，不能形成五条区带；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，形成一片，不易分辨出五条区带。 2.6点样用力不均匀或样品涂在玻片时不均匀。点样用力不均匀的结果是，样品有的点上去了，有的没有，这与