梓醇保护L-谷氨酸及Aβ25-35损伤PC12细胞作用比较.docVIP

梓醇保护L-谷氨酸及Aβ25-35损伤PC12细胞作用比较【摘要】 目的 观察梓醇对L-Glu和Aβ25-35损伤PC12细胞的保护作用的异同。方法 常规培养神经元样PC12细胞，预先加入梓醇及对照生理盐水24 h后分别加L-Glu 5 mmol/L和Aβ25-35 20μmol/L损伤24 h，K252a 干预组细胞在梓醇前1 h加入200 nmol/L K252a。MTT法测定细胞存活率，放射配基结合分析测定M2受体密度。结果 梓醇100 μmol/L明显提高细胞存活率(P95%。DMEM (Gibco ,USA)，Aβ25-35、L-Glu、K252a、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(sigma ,USA)，3 h-QNB(Amersham 公司，比活度1．54 TBq/ mmol)。Aβ25-35 用灭菌双蒸水溶解后配成100mol/L母液无菌分装，-20℃储存，临用前37℃孵育3~5 d使成为聚集状态[4]，加入DMEM稀释成所需浓度。 1．2 方法 1．2．1 细胞培养及处理 PC12 细胞由中国科学院上海细胞生物研究所提供，置CO2 培养箱内37℃常规培养，DMEM内含10%胎牛血清、0．1 U/L 青霉素和0．1 g/L 链霉素。细胞长至铺满瓶底约90%时收集细胞传代，24 h换液并加入不同浓度梓醇预处理细胞，正常对照和模型组细胞加等体积生理盐水。继续培养24 h，除正常对照组细胞外，其余细胞分别加入终浓度5 mmol/L L-Glu持续损伤24 h即细胞培养至72 h进行指标检测(所有加药体积均为10l/孔)。20mol/L Aβ25-35 损伤细胞的实验方法同上。 1．2．2 细胞存活率测定(MTT 法) 细胞以2×107/L接种于96 孔板，每孔200L。检测时每孔加5 g/L MTT溶液20L，使终浓度0．5 g/L，37℃孵育4 h，弃上清液，每孔加DMSO 150L，振荡10 min，酶标仪测490 nm 的光密度(OD)。细胞存活率(%)=用药组细胞OD/对照组细胞OD×100%。 1．2．3 细胞M受体密度测定 细胞以2×108/L较高密度接种于6 孔培养板内，每孔2 mL。M受体密度采用 3 h-QNB单位点结合法测定。培养细胞每孔加适量预冷至4℃的0．01 mol/L PBS轻轻刮取细胞，离心1 800 g×10 min得到细胞团块，加B1 缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 7．4，内含10 mmol/L MgCl2)混匀制成匀浆。测定时每管均加入细胞匀浆100L(约100~200g 蛋白)，总结合管(TB)加B1 缓冲液和3 h-QNB 液各100L，非特异结合管(NSB)加B1 缓冲液和阿托品各100L，总反应体积均为300L(以上所有操作在4℃进行)。37℃振荡孵育45 min反应，反应结束后立即置冰浴终止反应，迅速抽滤至双层69 型玻璃纤维滤膜，滤膜预先用0．25%PEI浸泡以降低非特异结合。滤膜80℃烘干1 h后浸入1 mL 0．6%b-PBD二甲苯溶液，液体闪烁仪测放射性计数率(cpm)，Lowry 法测定蛋白含量。PC12 细胞M受体密度计算公式=总结合(cpm)－非特异结合(cpm)测量效率(%)×标记物比活度(cpm/fmol)×标本蛋白量 1．2．4 K252a对梓醇作用的影响 细胞以2×105/ml 较高密度接种于6 孔培养板内，每孔2 mL。分为：正常对照组，模型组，梓醇终浓度100 μmol/L保护组和200 nmol/L K252a干预梓醇保护组。其中K252a干预组细胞在加梓醇保护前1 h即细胞培养至23 h预先加入终浓度200 nmol/L的K252a干预，余处理同前。同上测定细胞M受体密度。 1．3 统计学分析 所有数据以（x±s）表示，单因素方差分析，P0．05,差异有统计学意义。 2 结果 2．1 梓醇对PC12 细胞存活率的影响 正常细胞加入的MTT被细胞还原产生蓝紫色结晶，分布在胞体及突起部，含量丰富，L-Glu和Aβ25-35 20mol/L分别作用于PC12 细胞24 h后细胞蓝紫色结晶明显减少，说明细胞存活率明显下降，分别下降为正常对照组的62．4%和70．1%(P0．01)。梓醇10mol/L浓度预处理组细胞存活率较模型组增加，分别上升至正常组的69．7%和70．7%，与模型组比较差异有统计学意义(P0．05，n=9)。梓醇100mol/L作用组细胞存活率明显升高，分别为正常组的79%和79．7%，比模型组显著提高，差异有统计学意义， (P0．01)。 2．2 梓醇对PC12细胞M受体密度的影响 L-Glu和A